4.4.1 Synthèse protéique et protéolyse
L’homéostasie des myotubes dépend de l’équilibre entre synthèse et dégradation protéique, qui est le reflet de l’état métabolique des cellules. Nous avons évalué l’effet du TNFα et des différents inhibiteurs sur la protéo-synthèse et la protéolyse. Le taux de synthèse protéique a été mesuré par l’incorporation de tyrosine tritiée dans les protéines néosynthétisées. Le traitement des myotubes L6 par le TNFα induit une forte chute de la synthèse protéique de l’ordre de 25% après seulement 12 heures, et l'addition des inhibiteurs de synthèse de céramides limite cette baisse (figure 38).
Figure 38 : Effet du TNFα et des inhibiteurs de la synthèse de céramides sur la synthèse protéique.
Les myotubes L6 sont traités pendant 12 heures avec du TNFα 15 ng/ml, avec ou sans 100 nM myriocine ou 10 µM OMS, puis le milieu est remplacé par un milieu supplémenté en [3H]-Tyrosine pendant une heure. Les cellules sont ensuite lavées puis grattées et les protéines précipitées avec de l’acide tri-chloroacétique. Le taux de synthèse protéique est exprimé par la radioactivité du culot protéique en coups par minutes, rapportée à la quantité de protéines. Les moyennes +/- SEM de 3 expériences indépendantes sont présentées. ++ : différent de contrôle, p= 0,001. * : différent de TNFα seul, p≤ 0,05.
La protéolyse a été évaluée d'après le relargage de la radioactivité, incorporée par les myotubes après deux jours de culture en présence de tyrosine tritiée. Le TNFα tend à augmenter la protéolyse, et les inhibiteurs diminuent significativement la protéolyse en présence de TNFα (figure 39). Ces résultats montrent que la formation de céramides induite par le TNFα perturbe l'équilibre synthèse-dégradation en activant la protéolyse et en diminuant la synthèse.
4.4 Les céramides modifient l’équilibre entre synthèse et dégradation 4. Résutats
Figure 39 : Effets du TNFα et des inhibiteurs sur la protéolyse.
Les myotubes L6 sont d’abord marqués pendant 48 heures en présence de[ 3H]-Tyrosine, puis sont traités pendant 12 heures avec du TNFα 15 ng/ml, avec ou sans myriocine 100 nM ou OMS 10 µM, ou avec les deux.
Les cellules sont ensuite lavées et grattées, et les protéines précipitées avec de l’acide tri-chloroacétique (TCA).
La radioactivioté TCA soluble du milieu (correspondant aux acides aminés relargués) est mesurée et rapportée à la radioactivité incorporée par les cellules. Les moyennes +/- SEM de 3 expériences indépendantes sont présentées. * : différent de TNFα seul, p≤ 0,005.
4.4.2 Les céramides induisent une activation des voies de protéolyse
La dégradation des protéines au niveau des cellules est assurée essentiellement par deux voies : le système ubiquitine-protéasome, et l’autophagie, qui participent à parts égales à l’atrophie musculaire. Nous avons évalué l’effet de l’accumulation de céramides induite par le TNFα sur ces deux voies.
Le système ubiquitine-protéasome, qui cible en particulier les protéines myofibrillaires, consiste en une suite de trois étapes assurées par les protéines E1, E2, E3, qui catalysent la poly-ubiquitinylation séquentielle des molécules-cibles, et leur adressage vers le protéasome où elles seront dégradées (Urso 2009). L’atrophie musculaire est communément associée à l’activation d’un ensemble de gènes appelé atrogènes (Lecker et al. 2004), incluant les E3 ubiquitine-ligases atrogine-1 et MurF1 (Bodine et al. 2001) qui ciblent spécifiquement les protéines myofibrillaires telles que la myosine (Haas et al. 1982). Une des cibles privilégiée est le facteur d’initiation de la traduction eIF3f, connu pour être spécifiquement ubiquitinylé par l’atrogine-1, puis dégradé par le système protéasome en conditions atrophiques (Lagirand-Cantaloube et al. 2008).
L’autre voie de protéolyse, l’autophagie, a longtemps été négligée dans le cadre de l’atrophie musculaire du fait de la difficulté à détecter une augmentation de son activité in
vivo. Elle consiste en une voie compartimentée permettant la digestion lysosomale de protéines et d’organites séquestrés par un jeu de vésicules complexe (Wing et al. 2011).
Récemment, de nombreux marqueurs de l’autophagie tels que la cathepsine L, LC3 et GabarapL ont été associés à l’atrophie musculaire (Deval et al. 2001; Mammucari et al.
2007). Nous avons donc évalué les effets du TNFα et des inhibiteurs de la synthèse de céramides sur l’expression des atrogènes et la quantité protéique de eIF3f.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
contrôle myriocine TNFα TNFα+myr TNFα+GW
eIF3f, unités arbitraires
*
*
+ +
eIF3f
-tubuline
-Figure 40 : Effets du TNFα et des inhibiteurs de la synthèse de céramides sur l'expression de gènes impliqués dans la protéolyse.
Les taux d’ARNm d' Atrogine-1 (A) et LC3b (B) ont été mesurés par RT-qPCR dans des myotubesL6 traités avec 15 ng/ml de TNFα, et en présence ou non de 100 nM myriocine, 10 µM OMS ou 10 µM GW4869. Les taux sont normalisés par l’ARNm de TBP (TATA box Binding Protein). Les moyennes +/- SEM de 3 expériences indépendantes sont présentées. ** : différent de contrôle, p= 0,01. +++ : différent de TNFα seul, p≤ 0,001, + : p<0,05. C. Les myotubes sont traités pendant 3 jours avec ou sans TNFα et en présence ou non de 100 nM myriocine ou 10 µM GW. Les taux de eIF3f ont été mesurés par Western blot et normalisés par la tubuline. Les moyennes +/- SEM de 3 expériences indépendantes sont présentées. * : différent de TNFα seul, p< 0,005, + : p<0.05.
Nous avons observé que le TNFα augmente l’expression d'atrogine-1, tandis que la myriocine, GW4869 et OMS diminuent son expression, confirmant que l’accumulation de
A B
C
4.4 Les céramides modifient l’équilibre entre synthèse et dégradation 4. Résutats
céramides pro-atrophiques est un inducteur de la protéolyse protéasome-dépendante (figure 40A). Ceci est confirmé par une diminution concomitante de la quantité de eIF3f en présence de TNFα, et par sa restauration en présence des inhibiteurs (figure 40C). Par contre, le TNFα et les inhibiteurs n'ont pas d'effet significatif sur l'expression de MurF1 (non montré).
LC3b est un constituant des autophagosomes utilisé comme marqueur de l’autophagie (Kabeya et al. 2000), qui est augmenté en cas d’atrophie (Zhao et al. 2007). Les inhibiteurs de la synthèse de céramides diminuent de manière significative l’expression de l'ARNm de LC3b en présence de TNFα (figure 40B), suggérant que les céramides sont également capables d’activer l'autophagie lors de l’atrophie induite par le TNFα.