Rôle oncogénique d’EBP50 et d’IRSp53 dans les tumeurs DIPG

 EBP50

Le rôle oncogénique ou suppresseur de tumeur d’EBP50 est défini par sa localisation cellulaire. L’expression non-membranaire est généralement associée à la tumorigenèse (Vaquero et al., 2017). J’ai donc analysé la localisation d’EBP50 dans les cellules DIPG et étudié l’effet de sa sous-expression par ARN interférent. L’immunofluorescence ainsi que la microscopie électronique ont mis en évidence la présence d’EBP50 dans le cytoplasme, le noyau et la membrane de la cellule. De plus, la diminution de son expression entraîne l’activation de l’apoptose et la diminution de la prolifération ainsi que la diminution de la

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migration et de l’invasion. EBP50 aurait donc un rôle pro-tumoral dans ces lignées or le traitement par le PS exacerbe le niveau d’expression de cette dernière. La localisation étant un paramètre clé dans le rôle de la protéine, la recherche de la localisation d’EBP50 dans des tissus de tumeurs DIPG et sa comparaison à des tissus sains permettrait de valider le rôle oncogénique d’EBP50 dans ces tissus. Malheureusement à cause du manque de matériels biologiques disponible pour les tumeurs DIPG, je n’ai pas pu réaliser cette expérience.

EBP50 est capable d’interagir par ses domaines PDZ avec différentes protéines impliquées dans la croissance tumorale, dont la β-caténine. Dans certains cancers, tels que le cancer colorectal (Saponaro et al., 2018) ou le carcinome hépatocellulaire (Shibata et al., 2003), la translocation nucléaire de la β-caténine est liée à la perte de la localisation membranaire d’EBP50 et à la progression tumorale. En revanche, dans 23 échantillons de tissus post-mortem de patients DIPG, aucune localisation nucléaire de la β-caténine n’a été mise en évidence après immunomarquage (Ballester et al., 2013). La voie WNT ne semble donc pas activée dans les DIPG et impliquée dans le rôle oncogénique de la protéine EBP50.

La voie de signalisation PI3K-Akt pourrait être une des voies régulées par EBP50 à l’aide de son domaine PDZ1. En effet, au cours de mes travaux, j’ai montré que la diminution de l’expression d’EBP50 par un ARN interférent induit une diminution de l’activation de la protéine Akt par déphosphorylation. J’ai également mis en évidence une diminution de la phosphorylation des protéines sous-jacentes d’Akt qui sont PRAS40 et GSK3-α/β. EBP50 a déjà été décrite comme étant impliquée dans la régulation de la protéine Akt (Molina et al., 2010). De plus, RS5517, une molécule spécifiquement développée par Saponaro et al. interagit et inhibe les liaisons avec le domaine PDZ1 d’EBP50 (Saponaro et al., 2018). L’utilisation de cette molécule induit une diminution de la prolifération cellulaire identique à celle induite par l’utilisation d’un ARN interférent. Le domaine PDZ1 et les protéines qui interagissent avec ce dernier sont alors potentiellement impliquées dans la maintenance de la croissance cellulaire. Enfin, une étude du mélanome montre que l’inhibition de la phosphorylation d’Akt dans le noyau est due à la relocalisation nucléaire de PTEN en absence d’EBP50. Le domaine PDZ1 d’EBP50, séquestre PTEN au niveau du cytoplasme et permet ainsi l’activation d’Akt (Fang et al., 2015). Ces interactions pourraient être à l’origine de l’activation de la voie PI3K-Akt (figure 36).

Par ailleurs, la molécule SAHA, qui est aussi un HDACi, induit la surexpression de la protéine EBP50 mais augmente également le niveau de phosphorylation d’Akt dans des

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cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (Dudakovic et al., 2015). L’effet oncogénique d’EBP50 pourrait donc être lié à l’activation d’Akt dans les cellules DIPG. Il paraît nécessaire d’identifier les interactions moléculaires d’EBP50 afin de confirmer ou non ces hypothèses par technique de co-immunoprécipitation.

Enfin, les résultats obtenus avec la molécule RS5517 nous indique qu’une redistribution cellulaire d’EBP50 ou le blocage des domaines PDZ plutôt qu’une inhibition d’expression permettrait de mieux contrôler les effets de la protéine EBP50. En effet, elle est impliquée dans des voies de signalisation importantes à la survie des cellules saines. Il est donc préférable de limiter ses interactions plutôt que de bloquer entièrement son expression pour son utilisation en thérapie ciblée.

Après surexpression d’EBP50 par infection lentivirale, nous nous attendions à une hausse de la prolifération des cellules or aucun effet n’a été observé. Cela a aussi été validé chez le modèle Xénope. En effet, après la surexpression de l’ARNm EBP50 au stade 2

Figure 36 : Représentation des hypothèses pouvant expliquer les rôles d’EBP50 dans les cellules DIPG traitées au panobinostat.

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cellules, aucun changement phénotypique de l’embryon n’a été constaté pendant le développement jusqu’au stade 36. EBP50 étant une protéine adaptatrice, elle dépend de l’expression et de l’interaction avec d’autres protéines potentiellement impliquées dans la prolifération. L’hypothèse est que le niveau maximal d’interaction serait déjà atteint dans les cellules DIPG avant traitement, ce qui expliquerait l’absence d’augmentation de la prolifération cellulaire. Une seconde hypothèse serait que la vitesse de la division cellulaire est déjà au maximum en conditions contrôles et que la surexpression d’EBP50 ne peut donc pas augmenter la prolifération cellulaire.

Le PS étant un inhibiteur de plusieurs HDAC, il induit l’expression de gènes suppresseurs de tumeur ainsi que des gènes impliqués dans le maintien de la tumeur et dans le développement de mécanismes de résistance. Ces mécanismes ont été décrits pour d’autres HDACi (voir introduction chapitre II, II-2.4). J’ai pu observer que la surexpression d’EBP50 par infection lentivirale des lignées DIPG n’a pas d’effet sur la survie cellulaire. Cela suggère que la surexpression d’EBP50 induite par le PS n’est pas impliquée dans un mécanisme de résistance directe. En revanche, l’augmentation d’EBP50 pourrait être un signe de résistance indirecte par le maintien d’un niveau critique de la protéine nécessaire à la prolifération et à la survie des cellules DIPG.

 IRSp53

Ces travaux de thèse ont permis de mettre en évidence la surexpression de la protéine IRSp53 suite au traitement par le PS. Contrairement à EBP50, IRSp53 est surexprimée seulement au bout de 16 heures mais cette surexpression est transitoire en présence de PS. Une hypothèse serait que la cellule est capable de réguler l’expression d’IRSp53 après activation par le traitement. Les mécanismes mis en jeu sont à ce jour inconnus. Une analyse de microarray à mis en évidence la surexpression d’IRSp53 au bout de 2 heures de traitement par le SAHA dans les ostéoblastes. Ce résutat permet de confirmer la régulation épigénétique du gène BAIAP2/IRSp53.

Là encore, la production d’IRSp53 n’est pas dérégulée dans les tumeurs DIPG comparée au tissu sain. En revanche, la diminution de son expression par ARN interférent induit une diminution de la prolifération associée à une augmentation de la mort cellulaire des