Résumé et conclusions
L'administration intra-articulaire des corticostéroïdes est une pratique courante chez les patients souffrants d'arthrite ou d'arthrose, mais elle n'est pas complètement exempte d'effets secondaires ou de limitations, comme par exemple l'apparition de cristaux de corticostéroïde dans l'articulation ou la disparition rapide de la substance active de la cavité articulaire. Notre hypothèse de travail s'inscrit dans la recherche de moyens pour pallier ces inconvénients en recourant à des microparticules biodégradables (diamètre moyen d'environ 5 à 10 μm) dans lesquelles un corticostéroïde a été préalablement encapsulé, mais aussi pour accroître, bien entendu, l'efficacité du traitement. Ces vecteurs thérapeutiques ayant la propriété de libérer graduellement la substance active, ils sont susceptibles d’empêcher l'apparition de cristaux. En ce qui concerne le problème lié à la clairance rapide de la substance active au niveau de l'articulation, il est envisageable de le surmonter en incorporant dans les mêmes microparticules des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques (SPIONs). Les microparticules, rendues ainsi magnétiques, pourront être maintenues dans l'articulation à l’aide d’un aimant externe, tout en libérant graduellement la substance active.
L'objectif thérapeutique de notre projet est donc de traiter les symptômes comme la douleur et l'inflammation liées à l'arthrite par injection intra-articulaire d'une suspension de microparticules biodégradables contenant à la fois de l'acétate de dexaméthasone et des SPIONs.
Dans une première étape, nous avons optimisé la formulation des microparticles par le biais d'un plan d'expériences qui visait l'obtention de taux d'encapsulation élevés aussi bien pour l'acétate de dexaméthasone et que pour les SPIONs, ainsi qu'un diamètre d'environ 5 à 10 μm, favorable à une rétention magnétique optimale. En ce qui concerne ce dernier point, nous avons mis au point une méthode simple pour quantifier la rétention in vitro, ce qui nous a permis de démontrer une rétention accrue des particules de taille micrométrique par rapport à leurs homologues sub-micrométriques. Dans une deuxième étape, les microparticules optimisées ont été caractérisées du point de vue physico-chimique, en étudiant l'aspect de leur surface, la structure interne, la distribution des SPIONs dans la matrice, l'état d'oxydation du fer après encapsulation, les propriétés magnétiques et la libération in vitro de la dexaméthasone. De plus, afin d'évaluer la libération de la dexaméthasone dans un environnement inflammatoire similaire à celui présent dans une articulation atteinte d'arthrite, nous avons utilisé une méthode innovante basée sur un modèle de poche d'air dorsale chez la souris. Compte tenu de l'administration intra-articulaire envisagée pour ces vecteurs, l'étape suivante a été de caractériser leur interaction avec des cultures cellulaires de fibroblastes
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synoviaux, mais aussi leur comportement après injection intra-articulaire chez la souris saine, afin de révéler une possible activité pro-inflammatoire des microparticules ou de leurs composants individuels. Nous avons pu démontrer l'absence de toxicité in vitro et in vivo, mais aussi l'internalisation des particules dans les fibroblastes synoviaux par un mécanisme de phagocytose. De plus, par une expérience d'imagerie in vivo chez la souris, nous avons mis en évidence que le temps de rétention des microparticules est plus long - jusqu'à trois mois - en présence d'un aimant externe. L’étape finale et la plus importante de notre projet a été d'étudier l'activité biologique des microparticules dans un modèle d'arthrite induite par antigène chez la souris. Cette expérience a permis de démontrer que les particules présentent une bonne activité anti-inflammatoire. Néanmoins, une influence marquée de l'aimant sous-cutané n'a pas été observée. Les raisons pourraient être une faible rétention magnétique dans l'articulation ou l'importante variabilité de la réponse des animaux dans le modèle étudié.
Dans cette optique, l'utilisation d'un modèle d'arthrose sur des périodes d’observation plus longues sera plus appropriée pour mettre en évidence les bénéfices résultant de l'incorporation des SPIONs.
Ce projet de recherche ouvre de nombreuses perspectives dans deux directions importantes. Premièrement, grâce à leur adaptabilité, ces vecteurs polymères pourraient permettre l'encapsulation d'autres substances actives et leur libération pourrait être modulée en fonction du profil pharmacologique recherché en changeant la nature ou la masse molaire du polymère. De cette façon, de nouvelles stratégies de formulation adaptées à l'administration intra-articulaire pourraient être mises en œuvre pour des composés particulièrement actifs, comme par exemple les inhibiteurs de la p38 MAP-kinase ou de l’interleukine IL-1 qui ne peuvent pas être utilisés dans la clinique en raison de leur forte toxicité systémique. Une preuve dans cette possibilité est le fait que récemment nous avons pu incorporer dans des microparticules de PLGA, à des taux très satisfaisants, un inhibiteur de la p38 MAP-kinase, le VX 745. En se basant sur ces résultats très encourageants, un futur projet pourrait comparer l'activité biologique de ce type de particules dans des modèles animaux en administration intra-articulaire et en administration systémique. La seconde perspective ouverte par cette thèse serait la possible modification chimique ou physique des microparticules pour atteindre des cibles spécifiques dans l'articulation enflammée, comme par exemple l'intégrine v3, une molécule transmembranaire dimère surexprimée dans les vaisseaux neoangiogéniques, le récepteur de l'acide folique FR, surexprimé lui dans les macrophages synoviaux, ou encore la sélectine E, une molécule d'adhésion surexprimée dans l'endothélium vasculaire des tissus enflammés.
Abbreviations 77
Abbreviations
AIA antigen induced arthritis BSA bovine serum albumin
mBSA methylated bovine serum albumin CIA collagen-induced arthritis CT computer tomography
CTLA4-Ig cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4
DAPI 2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride DiO 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate
DMARD disease-modifying anti-rheumatic drug DMEM Dulbecco's modified Eagle medium DMOAD disease-modifying osteoarthritis drug DMSO dimethyl sulfoxide
DPPC dipalmitoyl phosphatidyl choline DSC differential scanning calorimetry DXM dexamethasone 21-acetate
EDX electron-dispersive X-ray spectroscopy EELS electron energy loss spectroscopy ELISA enzyme-linked immunosorbent assay FACS fluorescence activated cell sorting FCS fœtal calf serum
HBSS Hank's balanced salt solution
HPLC high performance liquid chromatography HSA human serum albumin
i-a. intra-articular
IGF insulin-like growth factor
IgG-HRP immunoglobulin G-Horseradish peroxidase
IL-1 interleukin-1
IR infrared
MAPK mitogen-activated protein kinase
Abbreviations 78
MMP matrix metalloproteinase
MTT 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolim bromide
NIR near infrared
NSAID non-steroidal anti-inflammatory drug OA osteoarthritis
PBCA poly(butyl cyanoacrylate) PBS phosphate buffer saline PCL poly(-caprolactone) PDLLA poly(D,L-lactic acid) PLA poly(lactic acid) PLGA poly(lactide-co-glycolide) PLLA poly(L-lactic acid) PVAL poly(vinyl alcohol) RA rheumatoid arthritis SEM scanning electron microscopy
SPIONs superparamagnetic iron oxide nanoparticles SQUID superquantum interference device
TEM transmission electron microscopy Tg glass transition temperature TGF transforming growth factor TNF tumour necrosis factor XRD X-ray diffraction