1) Validation de la quantité de l’ADN par dosage fluorométrique
Une analyse par dosage fluorométrique a été réalisée pour vérifier la quantité d’ADN après purification. A la fin du dosage, le logiciel fournit des données brutes qui sont exportées après avoir validé les résultats obtenus. Une courbe de la quantité d’ADN en ng/µL en fonction de la fluorescence est tracée et la validation se fait grâce au r2 et par la validation de la référence qui doit être comprise entre 1 et 2 ng/µL.
Pics des différents points de gammes
Pics des échantillons
Amplifications des amorces présentes dans la gamme Amplifications des amorces présentes dans les échantillons
Figure 15 : MeltCurve
0 20 40 60 80 100 194 238 189 208 Qu an tité d 'A D N e n n g/ µ L Sol
Comparaison de la quantité d'ADN récupéré
Protocole standard versus kits testés
S Z N P
Pour réaliser ce dosage, les 4 échantillons de sols purifiés avec les 4 protocoles ont été analysés en 3 répétions chacun, 1 plaque a été utilisé.
A partir des données brutes un graphique a été réalisé en faisant une moyenne des 3 répétitions de chaque échantillons et pour chaque protocole.
D’après le graphique, les quantités d’ADN observées entre les kits testés et le protocole standard sont différentes. Les ADN issus du kit N présentes une quantité nettement supérieure que les autres.
2) Validation de la qualité de l’ADN
a. Analyse de la qualité de l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose
Une analyse par électrophorèse a donc été réalisée pour vérifier la qualité des ADN après purification par les différents kits
Un gel d’agarose par électrophorèse a été réalisé pour chacun des quatre échantillons. Sur la figure ci-dessous, ont été déposés 3 répétitions de l’échantillon 238 de chaque protocole testé en parallèle à un marqueur de taille. Quelques soit l’échantillon, les résultats obtenus sont identiques.
Figure 16 : Résultat obtenus après une électrophorèse en gel d’agarose et une révélation au BET.
S Z N P ADN
ARN
Déchets et tâche de colorant Ladder
1Kb
Sur les gels les ADN ont bien été séparés, des ARN (encadrés en rouge) et des déchets (acides humiques encadrés en orange).
D’après cette photo, il n’y a pas d’impact sur la qualité des ADN concernant le mode de purification. En effet, seul la force du signal augmente dans les puits ce qui signifie qu’il y a plus d’ADN dans les échantillons purifiés dans certains kits.
Il est difficile de conclure sur la qualité des ADN avec cette méthode. La qualité sera évaluée par PCR quantitative.
b. Analyse de la qualité de l’ADN par test d’inhibition par PCR quantitative
Un test d’inhibition est réalisé pour vérifier la qualité de l’ADN en les diluant à 0.5 ; 2 ; 5 et 10 ng. Un ADN est de bonne qualité lorsqu’aucun inhibiteur de PCR n’empêche la réaction d’amplification de PCR. Une quantité d’ADN trop importante peut être un inhibiteur de PCR comme des polluants co-extraits avec l’ADN mal éliminés par la méthode de purification.
Pour ce test, les 4 échantillons ont été analysés en les diluant chacun à 0.5 ; 2 ; 5 et 10 ng en 1 répétition. 3 plaques qPCR ont donc été réalisées.
Avant d’exporter les résultats et de les analyser, il faut valider différents paramètre de l’analyse. o Validation de la PCR quantitative :
Validation de la gamme : Il faut analyser l’Amplification Plot et la courbe standard pour valider la gamme.
Pour valider la gamme, il doit y avoir un logarithme (1 log=1 carré sur le graphique) entre chaque point de gamme. La gamme doit être homogène c’est-à-dire des dilutions successives au 1/10e et les répétitions doivent être cohérente.
Le coefficient de corrélation est supérieur à 0.990, il est de 0.998 cela signifie qu’il y a une bonne linéarité. L’efficacité de la PCR est de 98,012% sachant qu’elle doit être comprise entre 85% et 110%. Le slope doit être compris entre -3,1 et -3,74, il est de 3,371.
Le coefficient de corrélation est supérieur à 0.990, il est de 0.998 cela signifie qu’il y a une bonne linéarité. L’efficacité de la PCR est de 98,012% sachant qu’elle doit être comprise entre 85% et 110%. Le slope doit être compris entre -3,1 et -3,74, il est de 3,371.
La gamme est donc validée. Les échantillons peuvent donc être analysés pour être validés à leur tour. La validation des échantillons se fait par :
- Le témoin négatif, tous les échantillons doivent se situer à au moins 1 log de celui-ci.
- La droite d’étalonnage, tous les échantillons doivent être compris dans l’intervalle défini par la gamme.
- La Melt-Curve, un seul pic doit être observable au niveau de la gamme et 1 pic décalé de la gamme doit être observable pour les échantillons.
Les échantillons sont donc validés, les analyses sur les tests d’inhibition peuvent être réalisées.
Témoins négatifs
VALIDE
VALIDE
10 ng
5 ng 2 ng
0,5
o Résltats du test d’inhibition :
Sur la figure ci-dessous sont représentées les courbes d’amplification (phases plateau) d’un échantillon apporté en ces 4 quantités différentes dans l’analyse. Quelques soit l’échantillon, les résultats obtenus sont identiques.
Ces courbes montrent un même niveau de phase plateau pour les dilutions à 0,5 ; 2 et 5 ng. En revanche, le plateau pour la dilution à 10ng est atteint plus vite. Il y a beaucoup de produits ADN apporté dans la réaction que cela gêne la bonne réalisation de l’amplification, la phase plateau arrive alors plus rapidement.
Quel que soit le protocole utilisé, une inhibition de PCR est constatée à 10ng quoiqu’elle ne soit pas systématique pour les kits N, S et Z.
Pour mieux visualiser les résultats, une courbe de la quantité d’ADN apporté dans le puits initialement en fonction du nombre de copies par puits est tracée pour vérifier qu’il y a bien une absence d’inhibition de 0,5 à 5 ng.
Le coefficient de corrélation est supérieur à 0,9, il vaut 0,9998 cela signifie qu’il y a une bonne linéarité donc qu’il y a une absence d’inhibition entre 0,5 et 5 ng. Cette inhibition signifie que l’ADN est de bonne qualité puisqu’aucun inhibiteurs de PCR n’empêche la réaction d’amplification de PCR avant 10ng. En effet les réactions de PCR quantitatives sont également effectuées sur des quantités d’ADN très faible et inférieures à 5ng.
R² = 0,9998 0 1 2 3 4 5 6
0,00E+00 1,00E+05 2,00E+05 3,00E+05 4,00E+05 5,00E+05
Q u an ti té d 'A DN ap p o rt é/p u its ( n g ) Nombre de copies/puits
Vérification de l'absence d'inhibition de l'ADN
par qPCR
Courbe d’amplification PCR pour l’échantillon 189 purifié avec le protocole N
0,00E+00 1,00E+05 2,00E+05 3,00E+05 4,00E+05 5,00E+05 6,00E+05 7,00E+05 8,00E+05 194 238 189 208 N o m b re d e cop ie s/n g Sol
Comparaison de la densité microbienne
Protocole standard versus kits testés
S Z N P
3) Validation de l’outil de diagnostic de routine par PCR quantitative
Dans le protocole standard de PCR quantitative, l’ADN est ajouté à raison de 2 ng/puits. Cette même analyse de routine a donc été effectuée sur les ADN propre obtenus avec les différents kits.
Le graphique ci-dessous montre la comparaison de densité microbienne obtenue avec le protocole standard par rapport aux kits testés.
Ce graphique montre que la densité microbienne des sols 189 et 208 est similaire. La densité microbienne ne varie pas du protocole standard par rapport aux kits de purification.
Les résultats de densités microbiennes du kit P pour le sol 194 et celle du S pour le sol 238 proviendraient d’une erreur de manipulation.