Résultats

Récolte des cellules suivant le détachement des MSC

L’étape préliminaire d’ensemencement des MSC le jour avant l’essai de migration cellulaire nous a permis d’évaluer l’efficacité de chaque méthode de détachement pour récolter les cellules adhérentes des flacons T75. En supposant que le nombre de MSC dans chaque flacon est de 300,000 cellules, il a été observé que les méthodes TE2 et TE5 permettaient de récupérer 98±4.5 % des cellules dans le flacon. 75.5±5.4% des cellules ont été récupérées en utilisant la méthode CDB. La méthode PE a été la méthode moins efficace pour récupérer les cellules du flacon, car uniquement 52.2±6.2% des cellules ont pu être récupérées (p < 0.001 PE vs. TE2 et p < 0.01 PE

vs. CDB). Pour les quatre méthodes évaluées, une viabilité cellulaire excédant 90% a été obtenue.

La concentration de trypsine affecte l’expression de PDGF-R et la migration des MSC vers le facteur PDGF-BB

Les lysats provenant de suspensions cellulaires préparées en utilisant les méthodes TE5, TE2, CDB et PE ont été analysées pour l’intégrité de PDGF-R par buvardage de type western. Des lysats

provenant de cellules adhérentes non détachées ont été également analysés comme condition contrôle. En comparaison aux lysats cellulaires préparés par les méthodes CDB ou PE, les lysats de cellules détachés par la méthode TE5 présentent en moyenne une plus forte dégradation de PDGF-R (Figure 6.1, p<0.05 TE5 vs. CDB et PE). Les lysats provenant des MSC détachées avec les méthodes CDB ou PE ont montré des niveaux d’expression de PDGF-R similaire aux lysats provenant de MSC intactes.

Figure 6.1 : Analyses de buvardage de type western montrant que les méthodes de détachement cellulaire à base de trypsine mènent à la dégradation de PDGF-R chez les MSC humains. A) Buvardage de type western montrant l’expression de PDGF-R et β-Actine chez les lysats cellulaires de MSC détachées en utilisant les méthodes TE2, TE5, CDB et PE, dans 4 expériences avec 3 donneurs. La condition TE10 indique un témoin positif où les MSC ont été détachées suite à une exposition de 10 minutes à la trypsine-EDTA 0.25%. B) Analyses densitométriques présentant la

moyenne du ratio de la densité PDGF-R/β-Actine (N=4). L’étiquette CTRL correspond aux MSC qui ont été lysées directement dans le pétri sans être détachées. Les barres d’erreurs présentées correspondent à l’écart type.

Un premier contrôle réalisé après la période de migration est d’évaluer la distribution des cellules adhérées à la surface de la membrane de la chambre de migration afin de s’assurer que celle-ci est homogène. Les MSC détachées en utilisant les méthodes TE5, TE2 et CDB ont adhéré de manière homogène à travers la membrane poreuse. En revanche, lorsque la méthode PE a été utilisée, les MSC ont eu tendance à s’agréger dans la chambre de migration, avec une morphologie « toile d’araignée». Il est possible alors d’observer des zones sur le filtre poreux où aucune cellule n’a adhéré sur la membrane (Figure 6.2, onglet A).

La migration des MSC détachées par les méthodes TE5, TE2, CDB et PE au facteur de croissance PDGF-BB (10 ng/mL) a été mesurée (Figure 6.2, onglets B et C). La migration des cellules vers le milieu α-MEM sans sérum a été utilisée comme témoin négatif. Dans le cas des méthodes TE5, TE2 et CDB, entre 2300 et 2900 cellules ont migré en moyenne au contrôle négatif α-MEM. Lorsque la méthode PE a été utilisée, moins de MSC ont migré vers le α-MEM (Figure 6.2, onglets B et C, p<0.05 PE vs. CDB et p<0.05 PE vs. TE5).

L’effet chimiotactique de PDGF-BB sur les MSC était variable en fonction de la méthode de détachement utilisée. En comparaison à leur contrôle α-MEM respectif, le PDGF-BB a induit une augmentation de la migration des MSC par un facteur de 2 lorsque les cellules ont été détachées avec la méthode TE5 (p=0.11 PDGF-BB vs. α-MEM) ou TE2 (p<0.05 PDGF-BB vs. α-MEM). Lorsque les cellules ont été détachées avec la méthode PE ou CDB, le PDGF-BB a augmenté la migration des MSC par un facteur de 3.5 à 4 respectivement (Méthode PE: p<0.08 PDGF-BB vs. α-MEM; méthode CDB: p<0.01 PDGF-BB vs. α-MEM). Toutefois, le plus grand nombre de MSC ayant migré au PDGF-BB a été observé lorsque les cellules ont été détachées par la méthode CDB (p<0.01 CDB vs. TE5, TE2 et PE).

Figure 6.2 : Résultats des essais de migration Transwell. La migration des MSC au PDGF-BB est plus élevée lorsque les cellules sont détachées en utilisant la méthode CDB en comparaison aux méthodes TE5 et TE2. A) Images représentatives de l’adhésion des MSC qui ont été détachées en utilisant la méthode TE5, TE2, CDB ou PE. Les cellules détachées en utilisant la méthode TE5, TE2 ou CDB adhèrent de manière homogène sur la membrane des chambres de migration. Les cellules détachées en utilisant la méthode PE s’agrègent. Les flèches rouges indiquent des espaces où les cellules n’ont pas adhéré. B) Images représentative des essais de migration avec des cellules détachées en utilisant la méthode CDB. Les images du haut présentent des champs contenant la totalité des cellules ensemencées dans la chambre. Les images du bas montrent des champs contenant uniquement les cellules ayant migré. C) Migration cellulaire estimée après 4 heures. Les astérisques indiquent les différences significatives entre les cellules migrant au PDGF-BB et l’α- MEM pour chaque méthode respective. * p<0.05; ** p<0.01. Les barres d’erreurs présentées correspondent à l’écart type.

La concentration de trypsine affecte l’expression en surface de CD29 et l’adhésion des MSC à l’atélocollagène.

Les MSC expriment le récepteur CD29 qui est l’intégrine qui permet l’adhésion des cellules au collagène. Dans notre analyse, CD29 a été détectée à la surface des MSC peu importe la méthode de détachement utilisée (Figure 6.3, onglet A). Toutefois, les méthodes TE5 et TE2 ont induit une

diminution de l’expression de CD29 en comparaison aux méthodes CDB et EDTA (Figure 6.3, onglets A et B, p<0.001). Cette diminution de l’expression de CD29 corrèle avec la capacité d’adhésion des MSC sur l’atélocollagène (Figure 6.3, onglet C).

Figure 6.3 : Expression de CD29 et adhésion des MSC sur l’atélocollagène. A) Histogrammes représentatifs de cytométrie en flux de cellules détachées en utilisant la méthode TE5 (rouge), TE2 (bleu clair), CDB (noir) et PE (orange) marquées avec l’anti-CD29 (lignes pleines) ou le contrôle isotypique (lignes pointillées). B) MFI des MSC exprimant CD29. C) Moyenne du nombre de MSC

adhérentes obtenu lors des essais d’adhésion cellulaire sur des surfaces non traitées, ou recouvertes avec de l’atélocollagène. Les barres d’erreurs présentées correspondent à l’écart type.