Résultats du pseudotypage

Les expériences présentées dans cette partie comparent l’efficacité de transduction et le tropisme de vecteurs lentiviraux pseudotypés avec les glycoprotéines G de l’enveloppe VSV, Mokola ou Rabies. Ces vecteurs ont le même transgène et le même promoteur. Les

différences observées seront attribuables uniquement au changement d’enveloppe et donc à l’efficacité que possède chaque vecteur à entrer dans la cellule.

a. Effet du pseudotypage in vitro

Des cocultures de neurones et d’astrocytes de striatum de rats ont été infectées avec les différents vecteurs à DIV11 et fixées à DIV21. Puis un double marquage immunofluorescent a été effectué permettant de visualiser les cellules exprimant le transgène nlsLacZ (en vert) et les astrocytes grâce au marqueur S100β ou bien les neurones avec le

marqueur NeuN (en rouge). Trois pseudotypages ont été testés avec le même promoteur PGK : le vecteur pseudotypé avec VSV (VSV-PGK-nlsLacZ), Mokola (Mokola-PGK- nlsLacZ) et Rabies (Rabies-PGK-nlsLacZ). Le transgène étant toujours nlsLacZ, nous nommerons nos vecteurs uniquement par leur enveloppe et leur promoteur.

Le vecteur VSV-PGK possède une efficacité importante concernant aussi bien le nombre de cellules infectées, 98% des cellules expriment le transgène, que le niveau d’expression du transgène comme le montre la figure 15. Mokola-PGK induit une expression plus faible du transgène avec 87% des cellules LacZ positives. Rabies-PGK ne permet qu’une expression très faible du transgène, les cellules transduites ne représentent alors que 75 % de la population. In vitro, les vecteurs sont dans le milieu de culture et nous ne changeons pas ce milieu avant plusieurs jours. Les vecteurs sont dans des conditions très favorables pour infecter les cellules. C’est pourquoi le pourcentage de cellules infectées est très élevé et même pour une enveloppe au tropisme très neuronal comme VSV, presque tous les astrocytes sont marqués. L’étude in vitro n’est peut-être pas assez discriminante, il est donc nécessaire d’étudier le tropisme en condition d’utilisation, c’est-à-dire in vivo.

b. Effet du pseudotypage in vivo

Des rats et des souris ont reçu des injections stéréotaxiques de vecteur lentiviral au niveau du striatum. Ces animaux ont été injectés les vecteurs VSV-PGK, Mokola-PGK ou Rabies-PGK. Trois semaines après l’injection, les animaux sont sacrifiés et les coupes de cerveaux subissent un protocole d’immunohistochimie.

-Effet du pseudotypage sur l’efficacité d’infection

Les coupes de rats et de souris ont subi un marquage immunohistochimique permettant de visualiser la protéine β-galactosidase afin de déterminer l’étendue de la zone d’infection dans le striatum des animaux.

Chez le rat (Figure 16) comme chez la souris (Figure 17), la plus forte efficacité d’infection s’observe avec VSV-PGK. Le niveau d’expression est très important, le marquage ne se situe pas uniquement au niveau nucléaire mais également dans les projections d’où l’intensité du marquage observée en A dans la figure 16. Avec Mokola-PGK (en B), l’intensité du marquage est plus faible, il se limite aux noyaux des cellules infectées mais le niveau d’expression du transgène et le nombre de cellules infectées restent importants. En revanche, l’efficacité d’infection avec Rabies-PGK (en C) est très faible, trop faible pour pouvoir par la suite espérer un effet fonctionnel avec un autre transgène.

Ces données confirment globalement les résultats portant sur l’efficacité d’infection observés in vitro. L’efficacité de transduction la plus forte est observée avec VSV-PGK. Une efficacité modérée est observée avec Mokola-PGK et enfin Rabies-PGK ne permet qu’une efficacité faible.

-Effet du pseudotypage sur le tropisme

Un double marquage immunofluorescent a été effectué sur les coupes de cerveaux de rats et de souris permettant de visualiser les cellules exprimant le transgène nlsLacZ (en vert) et les astrocytes grâce au marqueur S100β ou bien les neurones avec le marqueur NeuN (en rouge).

Tropisme in vivo chez le rat

Chez le rat (Figure 18 A et B) le tropisme de VSV-PGK est fortement neuronal avec 93 % des cellules infectées qui sont des neurones et seulement 4 % d’astrocytes qui expriment le transgène. L’enveloppe Mokola permet de modifier significativement le tropisme du vecteur, 56% des cellules infectées sont des neurones tandis que les astrocytes représentent 32% des cellules infectées. Concernant Rabies, les doubles marquages nous montrent un tropisme majoritairement neuronal avec un faible marquage des astrocytes, ce qui fait de cette enveloppe une option peu favorable au ciblage astrocytaire. Nous n’avons donc pas fait de quantification plus précise concernant cette enveloppe. Mokola est donc chez le rat l’enveloppe permettant le meilleur tropisme astrocytaire bien qu’il reste majoritairement neuronal.

Tropisme in vivo chez la souris

Chez la souris (Figure 19), le tropisme de VSV-PGK reste fortement neuronal avec 93 % de cellules LacZ-NeuN positives et seulement 9 % de S100β-LacZ positives. Au contraire le vecteur pseudotypé avec Mokola possède un tropisme majoritairement astrocytaire avec 18 % de cellules infectées qui sont NeuN positives et 68 % qui sont des astrocytes contrairement au tropisme observé chez le rat. Avec Rabies, le tropisme est légèrement plus astrocytaire que chez le rat mais reste en majorité neuronal, nous avons

éliminé cette option pour la suite de notre étude. Un vecteur pseudotypé avec Mokola reste la meilleure solution pour cibler les astrocytes in vivo, particulièrement chez la souris.

Amélioration de l’efficacité d’infection des vecteurs pseudotypés avec Mokola

Afin d’augmenter le nombre de cellules infectées par les vecteurs pseudotypés avec Mokola, nous avons injecté dans le striatum de souris différentes quantités de vecteurs.

testés ont été de 2, 4, 6 et 8µL. Cette expérience nous a montré que le volume maximal d’injection dans le striatum de souris sans qu’il y ait de transfert du vecteur du côté controlatéral est de 4µl. Pour la suite des expériences in vivo, nous avons donc injecté un volume de 4µl pour les vecteurs pseudotypés avec Mokola et de 2µl pour les vecteurs pseudotypés avec VSV.