Immunofluorescence sur cultures

Les cultures sont fixées avec du paraformaldéhyde 4%. Les lamelles sur lesquelles ont été ensemencées les cellules sont ensuite rincées dans du PBS, prétraitées avec 0,2% de Triton X- 100 dans 0,1 M de PBS pendant 20min puis dans du PBS 0.1 M, 10%NGS, 0.03% Triton X- 100 pendant 1h. Les lamelles sont incubées 3h à température ambiante avec l’anticorps primaire dilué dans du PBS 0.1M, 0.01% Triton X-100, 0.1% NGS. Après rinçage les lamelles sont incubées 1 h avec l’anticorps secondaire (dilution 1/500ème) couplé à un fluorochrome (AlexaFluor 488 ou 594). Les lamelles sont alors rincées et montées sur lames à l’aide d’un milieu de montage aqueux adapté à la conservation de la fluorescence (Fluorsave) et sont stockées à l'abri de la lumière à 4°C. Les concentrations utilisées pour les anticorps sont présentées dans le Tableau 3.

K. Analyse des immunomarquages

Une analyse par microscopie confocale a été menée pour étudier la colocalisation cellulaire des différents marqueurs en utilisant un microscope Zeiss Axioplan2 (Zeiss). Pour chaque condition, le nombre de cellules LacZ-NeuN positives et LacZ-S100β positive a été compté sur 6 images (objectif x63) par section, sur trois sections et sur trois animaux différents. L’intensité de fluorescence (exprimé en unité arbitraire) des cellules LacZ positives a été mesurée sur 3 images (objectif x40) par section sur trois sections et sur trois animaux grâce au logiciel MorphoExpert (Explora Nova) objective et in vitro sur trois puits différents et de deux ou trois cultures différentes. La quantification du nombre des cellules infectées et du volume d’infection a été faite avec le logiciel Mercator (Explora Nova). Le comptage a été fait sur 7 coupes par animal (distance intercoupe : 240 µm) et sur trois animaux (objective 5x). La segmentation des objets LacZ positifs a été faite grâce à un seuillage par intensité de lumière suivie d’un filtrage par taille et forme des objets. Le nombre de cellules estimé a été corrigé par le facteur Abercrombie (Coggeshall 1992). Les volumes d’infection ont été évalués à partir de coupes sériées en utilisant la méthode de Cavalieri. Dans l’exemple d’un volume V d’infection : V= S x k x n ;où k est la distance intercoupe, n le nombre de coupes présentant un marquage et S l’aire moyenne de la lésion sur les n coupes (Coggeshall 1992).

La quantification du volume de lésion après injection de quinolinate s’est faite sur les coupes immunomarquées pour DARPP32. Les zones présentant une baisse ou une perte du marquage ont été délimitées et les volumes quantifiés avec le logiciel MCID. Les volumes de lésion ont été évalués à partir de coupes sériées grâce à la méthode de Cavalieri.

L. Mesure autoradiographique de la consommation cérébrale de 2-deoxy-D- [14C]glucose (2DG)

Le deoxyglucose, qui est transporté comme le glucose, reste séquestré dans les cellules après sa conversion en deoxyglucose 6-phosphate par l’héxokinase ce qui permet d'évaluer la consommation de glucose par les cellules de cerveau en utilisant le modèle développé par Sokoloff (1977). Des souris injectées avec des vecteurs lentiviraux contenant le siGLAST ou siGLT-1 à droite et le siGFP à gauche reçoivent une injection intrapéritonéale de 2DG (0.15µCi/g). Les souris vigiles sont laissées dans leur cage pendant 45 min, puis sont euthanasiées avec une overdose de pentobarbital. Les cerveaux sont extraits, congelés dans de l’isopentane à -40°C. Ils sont ensuite coupés au cryostat en sections sériées de 20 µm d’épaisseur avec espace intercoupe de 60 µm. Les sections sont déshydratées au fur et à mesure de la coupe à l’aide d’un banc chauffant à 60°C et sont mises à exposées sur un film Biomax MR (Kodak) pendant 10 jours. Les films sont alors révélés en chambre noire et les autoradiogrammes sont digitalisés.

Dans nos conditions expérimentales, il n'est pas possible de calculer une consommation moyenne de glucose à proprement parler selon l'équation de Sokoloff, car nous n'avons pas réalisé de fonction d'entrée (Sokoloff, Reivich et al. 1977). Pour simplifier, nous utiliserons le terme de ‘consommation' de glucose alors que le paramètre véritablement mesuré est l’accumulation de glucose-6-phosphate radioactif dans le parenchyme cérébral. L’analyse des autoradiogrammes s’est fait avec le logiciel MCID. La région d’intérêt a été délimitée sur les coupes immunomarquées pour la protéine β-galactosidase. Un standard de radioactivité du carbone 14 a servi pour la conversion de la DO en nCi/g de 2DG. Les mesures se sont faites en comparant le côté gauche contrôle avec le côté droit sur 12 coupes adjacentes pour chaque animal en soustrayant la D.O du fond (non spécifique).

M. Analyses statistiques

Les résultats sont exprimés en moyenne ± l’erreur standard (SEM). L’analyse de variance (ANOVA) a été utilisée pour des comparaisons de moyennes entre groupes expérimentaux, suivie d’un test a posteriori PLSD de Fisher pour comparer les groupes deux à deux. Pour les comparaisons de données appariées (ex : comparaison entre striatum droit et gauche du même individu) un test t apparié a été employé. Pour les données non appariées, un test de Student non apparié à été effectué. Lorsque les données étudiées n’étaient pas paramétriques (ex : pourcentage) le test de Mann-Whitney a été utilisé.

Résultats et

discussion

V. Développement d’un vecteur lentiviral ciblant les

astrocytes in vivo

Dans cette première partie, notre objectif était de développer un vecteur lentiviral permettant une transduction des astrocytes in vivo de façon majoritaire et avec une efficacité importante. Nous avons utilisé pour cette étude le transgène nlsLacZ, produisant la protéine β- galactosidase dont l’accumulation est restreinte au noyau des cellules infectées. Ce transgène nous permet une visualisation individuelle des cellules infectées. Le vecteur VSV-PGK- nlsLacZ couramment utilisé dans la littérature et au laboratoire a un tropisme fortement neuronal, et nous servira de vecteur contrôle pour la comparaison avec les autres constructions. Au cours de ce travail, nous avons développé trois voies de recherche. Une première voie dans laquelle nous avons changé les protéines de l’enveloppe du vecteur lentiviral. Nous avons ainsi testé l’effet du pseudotypage sur le tropisme et l’efficacité d’infection avec les enveloppes VSV, Mokola et Rabies. La deuxième voie de recherche a consisté à utiliser un promoteur permettant une expression spécifiquement astrocytaire. Nous avons comparé l’effet sur le tropisme et l’efficacité d’infection de différents promoteurs : PGK, le promoteur ubiquitaire de la phosphoglycérate kinase ; CMV, le promoteur du cytomégalovirus et EAAT1, le promoteur du transporteur astrocytaire GLAST. Enfin, nous avons développé une troisième voie de recherche utilisant une nouvelle méthode de ciblage. Cette méthode basée sur un principe de sélection négative repose sur l’insertion, à la fin de la cassette d’expression, d’une cible endogène d’un microARN spécifique des neurones, afin de diminuer l’expression du transgène dans les neurones infectés par le vecteur lentiviral.

La sélection des vecteurs performants pour la transduction des astrocytes s’est faite sur plusieurs modèles. Tout d’abord, une première sélection s’est faite in vitro sur des cocultures primaires de striatum. Puis, les vecteurs ont été testés in vivo chez le rat et la souris.

A. Changement de pseudotype : VSV, Rabies et Mokola