R1
Figure 4 : Conception des inhibiteurs de la série B
C. Résultats pharmacologiques
L’évaluation pharmacologique des composés de la série B se fait systématiquement par mesure de l’inhibition de farnésylation et par mesure de l’inhibition de prolifération cellulaire (tableau 3). J’ai réalisée personnellement la mesure de l’inhibition de la FTase à l’Institut de Chimie des Substances Naturelles de Gif-sur-Yvette (Essonne). La méthode utilisée pour évaluer l’activité enzymatique met en jeu un substrat peptidique fluorescent (dansyl-GCVLS) dont la fluorescence augmente avec sa farnésylation, permettant ainsi de mesurer l’inhibition de farnésylation (Cassidy et al., 1995). Le pouvoir anti-prolifératif est évalué au laboratoire par le test MTT sur deux lignées cellulaires hormono-indépendantes du cancer de la prostate : DU145 (à métastases cérébrales) et PC3 (à métastases osseuses). Ces deux phénotypes cellulaires ont été choisies en raison de leur résistance marquée aux anticancéreux.
Le prodrug du L-739750 (IC50 (FTase) = 1,8 nM), le L-744832 (Calbiochem), a été utilisé comme composé de référence (figure 5). Il a été choisi en raison de son utilisation classique comme FTi de référence. Il est décrit avec des IC50(PC3) = 225 nM et IC50(DU145) = 20 µM (Sepp-Lorenzino et al., 2001), qui, dans notre modèle, sont respectivement de 75 µM et de 78 µM. De plus, une étude in vivo sur des souris xénogreffées, montre à 30 mg/kg une diminution de la tumeur de 85 % sur DU145 et de 87 % sur PC3 (Sirotnak et al., 2000).
N H2 N H O N H S H C H3 CH3 O SO2Me O O CH3 CH3
Figure 5 : Inhibiteur de référence L-744832
L’espaceur aminopipéridine-2-carboxylate de méthyle substitué par le 4-cyanobenzylimidazole comme chélateur de zinc contribuent à inhiber la FTase de
façon modérée avec des activité enzymatiques de l’ordre du submicromolaire (tableau 3). Le phénylalaninate de méthyle apporte les meilleurs activités enzymatiques, avec une IC50 de 34 nM pour l’énantiomère 2S (16) et de 76 nM pour le 2R (17). Les autres groupements hydrophobes amènent à des activités enzymatiques assez inférieures.
De manière inattendue, il ne se dégage pas de corrélation entre le pouvoir inhibiteur de la FTase et la configuration de l’atome de carbone 2. Plusieurs hypothèses ont été émises. Les composés étant testés sous forme de mélange d’épimères 4R et 4S, l’étude précise de leur énantiosélectivité est difficile. De plus, la flexibilité relative du fragment 4-aminopipéridine induit de multiples conformations qui peuvent donc s’agencer de différentes façons dans le site actif de l’enzyme, indépendamment de sa stéréochimie.
Tous ces composés sont des esters hydrolysables, au niveau cellulaire, en leur acide correspondant. Ils sont donc susceptibles d’être des prodrugs. Pour le vérifier, les acides correspondants seront préparés (par saponification), afin de mesurer leur activité enzymatique.
En dépit de leur faible activité enzymatique, la plupart de ces composés sont actifs sur les deux lignées cellulaires testées. Ce résultat inattendu peut s’expliquer, soit par la lipophilie du groupement carboxylate de méthyle, soit par l’inhibition d’une autre cible biologique. Contrairement à l’activité enzymatique, les composés 16 et 17 (avec phénylalaninate de méthyle) sont parmi les moins actifs sur ces deux lignées. Ces composés sont plus actifs sur la lignée DU145 que sur la lignée PC3. A l’exception des composés 41 et 42, tous les inhibiteurs de la série B disposent d’une activité anti-proliférative sur la lignée PC3 (inférieure au composé de référence, le
L-744832 (IC50 = 75 µM) dans notre modèle cellulaire).
FTase (nM) DU145 (µM) PC3 (µM) FTase (nM) DU145 (µM) PC3 (µM) A11 2 N.D. N.D. L-744832 27 78 75 16 2S 34 79 30% à 100 µM 17 2R 76 91 90 36 2S 557 21% à 100 µM 16 % à 100 µM 40 2R N.D. N.D. N.D. 37 2S 275 68 47 % à 100µM 41 2R 443 88 54 38 2S 571 63 48% à 100 µM 42 2R 191 54 71 Configuration R1 R1 Configuration O O O O O O O O O O IC50 IC50
Tableau 3 : Résultats pharmacologiques des composés de la série B
Des études de docking ont été effectuées, par le Docteur Amaury Farce, sur le composé 16, possédant le phénylalaninate de méthyle, disposant de la meilleure activité enzymatique. Le docking est réalisé à l’aide du programme GOLD sous SYBIL. Ces études s’appuient sur un algorithme génétique qui permet de positionner à partir du squelette du ligand ses descendants conformationels exerçants le plus d’interactions avec le site actif et engageant le moins de pénalités
(entropie conformationnelle et clash stérique). A partir de fonctions de scoring dix poses sont ensuite sélectionnées et évaluées statistiquement de façon consensus. Ces résultats sont alors investiguées grâce à l’œil avisé du modélisateur.
Il adopte une conformation en U. L’atome distale de l’imidazole chélate le zinc et son substituant 4-cyanobenzyle forme des interactions de type stacking avec les doubles liaisons du FPP. Le phényalaninate de méthyle vient se loger dans le « A2 binding site » formé par Tyr361β, Trp102β et Trp106β. Le groupement carboxylate de méthyle ne forme pas de liaison hydrogène avec la tyrosine mais se positionne à l’entrée de « l’exit groove ».
O O N N N CN NH O O Zn2+ FPP Trp102β Trp106β Tyr361β Cys95β Leu96β
"A2 Binding Site" "Exit groove"
Figure 6 : Docking du composé 16 dans le site actif de la FTase
Autour des composés de la série B, plusieurs modifications peuvent être envisagées (figure 7) :
X L’ester de méthyle, ne formant pas de liaison hydrogène avec Tyr361β, pourrait être remplacé par un autre groupement tel qu’un alcool, un acide carboxylique ou un amide primaire. Ceux-ci pourraient également être substitués par un groupement plus encombré (alkyle ou aryle), permettant ainsi de mieux interagir avec « l’exit groove ».
X La différence d’activité significative entre les amides (16 et 17) et les amines (36-43) suggère que l’utilisation d’autres acides aminés ou d’autres groupements alkyles hydrophobes améliorerait l’affinité avec le site actif de l’enzyme.
N N H N N NC O O OH O O A NH O A Remplacement de l'ester par :
Utilisation d'autres groupements hydrophobes
A= H, alkyle, aryle ( )n
n= 0,1
R1
II. Conception d’inhibiteurs avec un espaceur
1,4-diazépanique (série J, K et L)
D’autres composés ont été préparés en prenant en considération les relations structure-activté de la série B (figure 7). Une mini chimiothèque de 64 composés, d’une grande diversité et originalité chimique, a donc été préparée, facilement, par synthèse parallèle (figure 8) (Gilleron et al., 2006)
N N H N N NC R COO2Me Série B Mini chimiothèque de