Résultats généraux

a.Première série de test de résistance

Une bonne partie des lignées testées n'a pas présenté de phénotype particulier par rapport aux infections par PAO1. Les lignées qui apparaissent sensibles ou résistantes aux infections présentent la plupart du temps un écart faible par rapport au témoin. Nous avons

105 lignées cibles P[UAS] X

F1

Activation du gène X (insertion dans le bon sens)

UAS GAL 4 GAL4 da + Gène X

Lignée inductrice ubiquiste daughterless Gal4 (da-Gal4)

(contenant une insertion de l ’élément P au hasard dans le génome)

SURVIE

conservé la majorité des lignées présentant des écarts faibles par rapport au contrôle, pour les tester une deuxième fois en surexpression ou dans certains cas en perte partielle de fonction (absence du facteur Gal4) (en cours). Nous avons sélectionné les gènes candidats présentant soit une résistance, soit une sensibilité à l’infection.

Cette deuxième série de tests des lignées candidates est en cours d’analyse et permettra d’éliminer une bonne partie des faux positifs. Nous avons aussi choisi dans les lignées UY, certains gènes qui bien que ne présentant pas de phénotype particulier, pourraient avoir un rôle dans la réponse immunitaire d’après les données moléculaires des gènes ciblés par les éléments P[UY].

Dans un certain nombre de cas l’insertion de l’élément P est en inverse du gène situé à proximité (UY1358, UY1726….), il est difficile de savoir si les effets observés sont dus à une perte partielle de fonction ou non du gène à proximité duquel l’élément P est inséré ou à la dérégulation de gènes situés bien plus loin en aval. Il serait nécessaire de tester l’effet de l’insertion seule sur la résistance aux infections et de vérifier, par Northern blot, s'il y a bien une perte de fonction de ces gènes, la plupart de ces lignées n’ont pas été retenues. Dans cette partie, je ne présenterai, sauf indication, que des gènes où l’élément P est inséré dans le bon sens par rapport au gène cible. Les résultats sont préliminaires et sont à confirmer et à approfondir.

b.Détermination du site d’insertion par PCR-inverse

Les éléments UY sont insérés au hasard dans le génome, il est donc nécessaire de déterminer leur site d’insertion dans le génome par PCR-inverse. La majorité des sites d’insertion des éléments P a été cartographiée par l’équipe du Dr H. Tricoire. Après la première série d’infections, nous avons identifié par PCR inverse, le site d’insertion de quelques unes des lignées UY candidates. Le séquençage des bords flanquants de l’élément P

permet d’identifier les gènes correspondants par BLAST (Basic Local Alignment Search

Tool) par rapport au génome de Drosophila melanogaster (http://flybase.bio.indiana.edu/).

Nous avons déterminé le site d’insertion de cinq lignées candidates qui ont présenté en dans un premier temps une sensibilité ou une résistance aux infections (Tab. IV.1).

Tableau IV. 1 : Détermination du site d’insertion de l’élément UY dans le génome pour cinq lignées candidates

Lignées Sites d’insertion

UY2289 -inséré dans un intron du gène CG15186, UAS sens inverse, fonction inconnue. UY1597

(confirmation de l’insertion)

-inséré 38pb après le début de transcription du gène CG7841 (FBgn0036502), UAS sens inverse,

-inséré à 874 pb du gène Z600, UAS bon sens,

- inséré à 1195 pb du gène CG33088 (FBgn0053088), UAS bon sens, -inséré à 2803 pb du gène Eip71CD, UAS bon sens

UY1112 -inséré 493 pb en amont du début de transcription de l'adénylate kinase 1 (CG17146), UAS sens inverse

UY511 -inséré dans le gène CG6424 (FBgn0028494), perte de fonction putative pour le transcrit RA. Homologue de la protéine humaine ' protéine KIAA0914 '

UY1507 - inséré 162 pb après le début du transcrit du gène CG5505, codant pour une protéine UBP (Ubiquitin-specific Processing protease) possédant des orthologues chez les mammifères

La présence d’un élément P peut modifier l’expression d’un gène à plus de 10kb du site d’insertion (Nicolai et al., 2003)

c.Analyse des résultats

Les résultats obtenus au cours de ces tests sont difficilement reproductibles et nous en concluons que cette stratégie n'est pas applicable pour un crible à grande échelle et elle va être abandonnée. Actuellement, 35 % des lignées ont présenté un phénotype de résistance (Tab. IV.2) ou sensibilité au stress infectieux (Tab. IV.3) et font l’objet de tests plus apporfondis.

Parmi les lignées qui possèdent une insertion de l’élément P dans le bon sens et qui sont résistantes aux infections en contexte da-Gal4 : on retrouve des gènes du métabolisme (UY109, UY1083), un gène codant une protéine de régulation de l’expression de l’ADN (UY2006), un gène codant un composant de la matrice extracellulaire ten-m (UY1780) ainsi qu’un certain nombre de protéines de fonction encore inconnue. Ces effets demandent cependant une confirmation en testant l’effet de la surexpression sur la réponse aux stress infectieux sur un plus grand nombre d’individus et en regardant l’effet de l’insertion de l’élément UY potentiellement mutante sur la survie des mouches aux infections. L’effet sur la résistance suggère un rôle de ces gènes dans la potentialisation de la réponse immunitaire ce qui pourrait être testé en évaluant l’activation des peptides antimicrobiens, ou des gènes cibles de la voie des JNK ou de la voie des JAK/STAT…

¾ Implication de enabled : un gène impliqué dans le cytosquelette d’actine

L'insertion de l’élément P à proximité du gène enabled (ena) en absence d’inducteur

rend les mouches plus sensibles aux infections par ingestion de PAO1 (Tab. IV.4). L’élément

P pourrait induire une perte partielle de fonction de enabled, cequi reste à confirmer. enabled

code une protéine du cytosquelette pouvant fixer l'actine et participant à la dynamique du cytosquelette (Krause et al., 2003). Il s'agit d'un gène induit par le stress oxydant (Girardot et al., 2004), des expériences de RNAi en cellules S2 ont montré que la diminution de son expression conduit à une plus forte induction de la diptéricine après stimulation par le LPS

(Foley et O'Farrell, 2004). Ceci suggère que enabled jouerait un rôle dans le rétrocontrôle de

la synthèse des peptides antimicrobiens, peut-être pour éviter une activation anarchique des gènes cibles de Relish en l’absence d’infection. Chez les mammifères, les protéines de la famille Ena/VASP participent à la phagocytose dépendante du récepteur Fc en régulant le cytosquelette d’actine (Coppolino et al., 2001). La sensibilité que nous avons observée, pourrait être liée à un défaut dans la régulation de la synthèse des peptides antimicrobiens ou à un problème de phagocytose.

¾ Implication de la ferritine

L’insertion UY1102 dans le premier intron du gène fer1HCH (chaîne lourde de la

ferritine) peut induire une perte partielle de la fonction du gène. Le test de l’insertion seule a montré un phénotype de sensibilité aux infections naturelles (Tab. IV.4). Des expériences ont montré que la protéine est présente dans l’hémolymphe, sa concentration augmente rapidement après infection des larves (Vierstraete et al., 2003; Vierstraete et al., 2004). Au contraire, chez l’adulte, des approches protéomiques de la réponse immunitaire ont montré une diminution de sa concentration 6 heures après infection par des champignons (Levy et al., 2004). La ferritine est une macromolécule qui pourrait participer à la réponse immunitaire.

Figure IV. 2 : Expression de la proteine fusion FER1HCH-GFP (lignée G00237) dans les hémocytes larvaires.

La totalité des hémocytes présente une fluorescence associé à l’expression de la GFP (A, B) par rapport aux hémocytes w1118 (C). L’intensité de fluorescence est variable entre les cellules, le marquage est souvent ponctué suggérant la présence de la ferritine dans des vésicules. A, C grossissement x40, B grossissement x100.

Nous avons analysé l’expression de la chaîne lourde de la ferritine à partir des lignées

transgéniques « fly trap », où le gène de la GFP (Green Fluorescent Protein) peut former un

exon supplémentaire avec à ses extrémités un site accepteur ou donneur d’épissage lorsqu’il est inséré dans intron d’un gène endogène (Kelso et al., 2004). Cette insertion permet la création d’une protéine fusion (protéine endogène-GFP) qui permet de suivre la localisation cellulaire et tissulaire de la protéine dans l’organisme. Il existe deux lignées de ce type qui nous ont permis de montrer que FER1HCH (FER1HCH -GFP) était exprimée dans les hémocytes de la larve (lignée G00237 et G00188) (Fig. IV.2). Au cours de la réponse immunitaire, les hémocytes pourraient rapidement sécréter la ferritine dans l’hémolymphe, ce qui reste à démontrer.