Figure 4.5 – Schéma de principe d’une expérience de mesure de temps de vie de fluorescence (TCSPC : Time Correlated Single Photon Counting, APD : Single Avalanche Pdo- toDiode).
actuel de ce type d’instrument [15].
4.3
Résultats expérimentaux
4.3.1
Mesure de molécules uniques et traitement des données
Des exemples typiques de temps de vie et d’intensité du signal de fluorescence, pour les trois géométries d’échantillons, sont donnés sur la figure 4.7a. Le photoblanchiment visible par la chute abrupte du niveau du signal sur la figure 4.7b confirme que ces mesures sont faites sur des émetteurs uniques. Les codes couleurs choisis permettent de différencier les trois types d’échantillons mesurés : le bleu pour les molécules isolées, le vert pour les molécules à proximité d’une seule particule d’or (liée avec deux longueurs de brins d’ADN différentes de 50 pb et 30 pb) et le rouge pour une molécule placée au centre d’un dimère (lié également avec un double brin d’ADN de séquence 30 bp ou 50 pb).
Figure 4.6 – Exemple d’image de fluorescence de dimères liés avec un double brin d’ADN de 50 paires de bases, alimentés au centre par une molécule d’ATTO647N unique, capturée par la caméra EMCCD (temps d’acquisition 100 ms, gain de 100, puissance incidente 30µW ).
a) b)
Figure 4.7 – (a) temps de vie de fluorescence typique (b) signal de fluorescence (moyenné sur 100 ms) de molécules d’ATTO647N pour un émetteur isolé (courbe bleue, temps de vie estimé 3.2± 0.150 ns), NPAu seule fonctionalisée avec un brin d’ADN de 50 bp (courbe verte, temps de vie estimé 310± 10 ps), dimère de 30 pb (courbe rouge, temps de vie estimé 35±5 ps).
La décroissance de l’ATTO547N seul, sur la figure 4.7a, est nettement mono-exponentielle et correspond à un temps de vie mesuré de 3.2 ±0.1ns. Par contre, les courbes verte et rouge n’ont pas une allure de déclin du temps de vie de type mono-exponentiel. Ceci est dû à l’influence de l’IRF sur la forme des courbes. Pour estimer sans ambiguïté ces temps
4.3. Résultats expérimentaux 85
de vie courts, nous ajustons les données avec une convolution de l’IRF et d’une fonction mono-exponentielle décroissante [15] comme représenté sur la figure 4.8. Sur cette figure, les courbes continues de couleur (bleue, verte, et rouge) sont les mesures de déclin du signal de fluorescence de l’ATTO647N isolée, du monomère 50 pb et d’un dimère 30bp. La courbe continue noire représente l’IRF. L’ajustement par la convolution de l’IRF avec une fonction mono-exponentielle décroissante est représenté par les courbes en pointillés noirs. La courbe verte, qui correspond à un monomère fonctionnalisé avec un brin de 30 pb, indique une réduction du temps de vie de fluorescence d’un ordre de grandeur comparé à la molécule isolée (310 ±10ps). Pour le dimère de 30 pb, le temps de vie de fluorescence est estimé à 35 ± 5 ps, soit 91 fois plus court que le temps de vie mesuré sur la molécule isolée. Cette parfaite correspondance entre l’ajustement et la mesure expéri- mentale, confirme que les données ont bien une décroissance mono-exponentielle. Par ce procédé d’analyse, notre résolution temporelle est de l’ordre de 10 ps. Pour confirmer la forte modification du temps de vie dans les échantillons de dimères et pour comprendre ce phénomène entre les différentes géométries d’échantillons, nous réalisons une étude statistique sur un grand nombre de molécules.
7,2 7,3 7,4 7,5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 7.5 8 8.5 9 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 In t-fluo Temps(ns) Temps(ns) In t-fluo 8 10 12 14 16 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Temps(ns) In t-fluo
Figure 4.8 – (a) IRF (courbe continue noire) convoluée avec une fonction mono-exponentielle dé- croissante (courbe en pointillée noire) utilisée pour ajuster les mesures expérimentales (courbes continues : bleue ATTO647N isolée (τ = 3.2± 0.1 ns), verte Monomère 50 pb (τ = 310± 10 ps) rouge pour le dimère de 30 pb (τ = 35± 5ps).
4.3.2
Analyse statistique de l’exaltation des taux d’émission
spontanée
L’analyse statistique des mesures de l’exaltation du taux d’émission est réalisée sur 420 molécules dans des configurations différentes : molécules d’ATTO647N isolées ; à proximité d’une NPAu, et au centre de dimères. Les monomères et les dimères sont fonctionnalisés avec deux longueurs de brin différentes, 50 bp et 30 bp. Au total 81% des mesures ont pu être ajustées par l’IRF convoluée avec une fonction mono-exponentielle décroissante ; 8% ont été rejetées de l’analyse suite à un faible rapport signal à bruit (dû à un photo- blanchiment précoce) et 11 % présentaient des décroissances bi-exponentielles (associées à un signal de fond important ou à plusieurs molécules dans le même volume focal). L’association du déclin mono-exponentiel et de la stabilité des signaux de fluorescence en
fonction du temps (figure4.7b), indique que l’orientation de la molécule est stable pendant la mesure. Une conclusion similaire a été donnée par des mesures d’anisotopies résolues en temps avec des molécules fluorescentes zwitterioniques et cationiques attachées à un double brin d’ADN [104, 105]. Le résultat de cette analyse indique que la rotation de la molécule est entravée par l’interaction avec la double hélice d’ADN (probablement en se liant dans le grand sillon). La figure 4.9 représente les distributions mesurées de l’exalta- tion du taux d’émission normalisé Γ/⟨Γ0⟩, avec ⟨Γ0⟩ la moyenne du taux d’émission de la molécule d’ATTO647N isolée. Nous rappelons que Γ est inversement proportionnel au temps de vie de fluorescence Γ = 1/τ .
1 5 10 50 100 200 0 0.1 0.2 1 5 10 50 100 200 0 0.1 0.2 1 5 10 50 100 200 0 0.1 0.2 1 5 10 50 100 200 0 0.1 0.2 1 5 10 50 100 200 0 0.1 0.2 i ii iii iv v P robabilit é Γ/<Γ0>
Figure 4.9 – Distribution de l’exaltation du taux d’émission Γ/⟨Γ0⟩. Molécules d’ATTO647N iso-
lées (i), monomères de 50 bp (ii), et 30 pb (iii), dimères de 50 pb (iv) et 30 pb (v). La largeur de la barre expérimentale ∆Γ/Γ=∆τ /τ =0.12. La courbe continue noire (i) est un ajustement gaussien des distributions expérimentales Γ0/⟨Γ0⟩. Les courbes
continues noires (ii-v) correspondent aux calculs théoriques de Γ/⟨Γ0⟩ en formulant
l’hypothèse d’une orientation du dipôle isotrope de la molécule, avec une distance émetteur-particule fixée à 8 nm pour les brins d’ADN de 50 pb (ii,iv) et à 6 nm pour les brins d’ADN de 30 pb (iii,v). Ces distributions sont pondérées avec une dépendance en angle de l’efficacité de l’antenne. Les courbes hachurées noires (ii-v) sont des dis- tributions théoriques de Γ/⟨Γ0⟩ pour θ = π/4 avec une distribution gaussienne de d
centrée à 6.5 nm et 8.25 nm pour les brins d’ADN de 30 bp et 50 bp, l’écart type de d est à±0.5 nm pour une particule seule (ii,iii) et ±1 nm pour les dimères (iv,v).
Sur ce graphique, nous observons que les mesures de l’exaltation du taux d’émission faites sur un grand nombre de MUs, isolées et influencées par une ou deux NPsAu pour différentes longueurs de brin d’ADN, confirment une modification drastique du compor- tement des 5 échantillons. Cette modification est visible par la variation de l’exaltation