1.6 Conclusion
2.1.2 Purification par électrophorèse : séparation de particules monofonc-
Le contrôle du nombre de courts brins d’ADN pour des particules supérieures à 20 nm, est une limite technologique qui n’a pas encore été franchie. La purification électrophoré- tique est une technique basée sur la différence de vitesse de diffusion, sous champ électrique statique, de biomolécules dans un gel aqueux. Pour une séparation efficace des particules greffées avec un nombre connu de brins d’ADN, les particules passivées doivent avoir une
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Figure 2.2 – La phosphine et le brin d’ADN sont chargés négativement. Les forces de répulsion induites ne permettent pas l’adsorption de ADN-or. Par écrantage des charges (Na+), le brin d’ADN vient se greffer spécifiquement par liaison covalente à la surface de l’or. La phosphine qui entoure les particules est remplacée par un court oligomère neutre (Poly ethylene glycol) thiolé (PEG), pour augmenter la stabilité des groupements or- ADN.
différence de mobilité électrophorétique significative, liée à leur volume hydrodynamique et à leur charge. En pratique, les solutions que l’on souhaite purifier sont placées dans un gel formé d’agarose (polymère de sucre) et d’une solution tampon (dans notre cas du TBE : mélange de Tris, d’acide borique et d’EDTA). Une grande concentration d’agarose dans le gel réduit la taille des pores dans lesquels les objets peuvent migrer et leur vitesse de diffusion est diminuée. La concentration d’agarose est importante car elle détermine la taille des objets que l’on désire purifier. Les NPsAu sont chargées négativement, et donc, sous l’effet d’un champ électrique, elles migrent vers l’anode à travers les pores du gel de sucre.
La solution de colloïdes d’or inférieurs à 100 nm a une couleur rouge caractéristique de la résonance plasmon (530 nm). Contrairement à la purification electrophorétique de brins d’ADN, il n’est pas nécessaire d’utiliser des colorants pour visualiser le résultat final dans le gel d’agarose. La séparation des nano-structures est visible directement grâce à la cou- leur rouge de la solution colloïdale. Nous verrons dans la suite de ce chapitre des exemples de purification sur gel d’agarose, dans lesquels nous visualiserons nettement différentes bandes de couleur rouge distribuées verticalement entre la cathode et l’anode. Ces bandes indiquent la présence de particules fonctionnalisées ou de groupement de NPsAu que nous pouvons séparer par électrophorèse.
Par exemple, pour des particules d’or de 5 nm de diamètre, la formation de bandes séparées est possible en greffant des brins d’ADN d’une longueur de l’ordre de 50 bases
(17nm) [62]. La figure 2.3, tirée de l’article [57], illustre la purification de NPsAU de 5 nm, 8 nm et 18 nm liés à différentes longueurs de brins d’ADN. Les charges surfaciques des NPsAu étant négatives, elles migrent vers l’anode sous l’influence d’un champ électrique (la flèche noire indique la direction de diffusion vers l’anode). Les particules de 5 nm de diamètre ont été associées à des mono-brins de 50 bases (colonne 6). Comparativement à des particules nues (passivée par du BSPP, colonne 5) les bandes supplémentaires, faiblement séparées, indiquent le greffage d’un ou deux brins d’ADN. Dans le cas des particules de 18 nm, des brins d’ADN de 100 bases ont été utilisés (colonne 8). A nouveau, des bandes apparaissent par rapport aux particules ne comportant pas d’ADN thiolé (colonne 7). Le cas des NPsAu de 8 nm de diamètre est différent et démontre la flexibilité du greffage contrôlé d’ADN. Les colonnes 1 et 2 correspondent, respectivement, à des particules nues et à des particules d’or conjuguées avec un unique brin de 100 bases (complémentaire de celui utilisé avec les particules de 18 nm), préalablement purifiées par électrophorèse. Les colonnes 3 et 4 (identiques) démontrent qu’il est possible de greffer un unique brin de 50 bases sur une particule comportant déjà un brin de 100 bases, avec des séquences totalement décorrélées (dans ce cas la séquence de 50 bases est complémentaire de celle greffée sur les particules de 5 nm). L’hybridation de ces différents objets permet d’obtenir des trimères asymétriques de particules de 5 nm, 8 nm et 18 nm de diamètre [57].
Figure 2.3 – Purification de particules de 5 nm de diamètre (colonnes 5 et 6) de 8 nm (colonnes 1-4) et de 18 nm de diamètre (colonnes 7, 8). Les colonnes 1, 5 et 7 sont des bandes de référence de particule simplement passivées de BSPP. La colonne 2 correspond à des particules liées à un unique brin de 100 bases. Les colonnes 3 et 4 montrent des NPsAu fonctionnalisées avec un brin de 100 bases et plusieurs brins de 50 bases. La colonne 6 illustre la purification de particules de 5 nm greffées avec un brin de 50 paires de bases. La colonne 8 caractérise la purification de particules de 18 nm fonctionnalisées avec un brin de 100 paires de bases.
Nous avons vu dans le chapitre d’introduction que la fabrication d’une nano-antenne nécessite de fortes sections efficaces de diffusion. Pour cela, les particules doivent avoir une taille supérieure à 30 nm de diamètre [51, 52], et la distance inter-particule doit être infé- rieure au rayon de la particule (pour obtenir un fort couplage plasmon), ce qui nécessite l’utilisation de courts brins d’ADN [59, 60]. Cependant, pour des NPsAu plus larges que 30 nm de diamètre, les brins d’ADN greffés devraient probablement présenter plusieurs
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centaines de bases en longueur avant d’observer une différence significative de vitesses de diffusion dans le gel d’agarose.
La figure 2.4 montre le résultat final de la purification électrophorétique de particules d’or de 40 nm passivées de PEG méthylé et thiolé (colonne 1) et conjuguées avec des brins d’ADN trithiolés de 30 bases (colonne 2, après 12 heures d’incubation avec un excès de (×33) de brins d’ADN dans une solution de NaCL 30 mM).
Figure 2.4 – Purification par électrophorèse de particules passivées de PEG (colonne 1) et fonction- nalisées d’un brin d’ADN trithiolé de 30 bases (colonne 2).
Nous pouvons constater que la colonne 2 ne présente pas de bandes avec des vitesses de diffusion distinctes. La seule bande visible est légèrement ralentie comparée à la colonne 1, ce qui indique une augmentation du volume hydrodynamique des particules lorsqu’elles sont fonctionnalisées avec l’ADN. A ce stade, il est impossible d’estimer le nombre de brins greffés par particule. Pour pallier à ce problème, une solution consiste à augmenter la longueur effective de l’oligonucléotide trithiolé, afin d’augmenter, de façon significative, la différence de mobilité électrophorétique des particules une fois l’ADN greffé.