Résultats et discussions

2.4.1 Localisation de Sub1 sur le génome

L’analyse de l’occupation de Sub1 sur le génome a été réalisée par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) suivie d’une hybridation comparative sur puce à ADN (ChIP on chip) (figure 1 de l’article). La puce à ADN utilisée présente non seulement des ORF (open reading frames ; cadres de lecture ouverts) mais également des régions intergéniques contenant des gènes de classe III (Harismendy et al., 2003). Environ un quart des loci sur lesquels Sub1 est retrouvé sont situés dans des ORF qui représentent globalement des gènes activement transcrits. Cette observation est en accord avec la fonction de coactivateur de Sub1 dans la transcription par l’ARN Pol II.

Les autres loci sur lesquels Sub1 est retrouvé correspondent à des régions intergéniques et à des gènes non traduits. On y trouve de manière intéressante les LEPTM (loci enriched by the Pol III

transcription machinery) (Harismendy et al., 2003) qui contiennent les gènes d’ARNt, RDN5, SNR6, RPR1 et SCR1, tous transcrits par l’ARN Pol III. Des expériences complémentaires de ChIP couplées à

des amplifications d’ADN par PCR quantitative confirment la présence de Sub1 sur des gènes de classe III. La protéine Sub1 est donc in vivo associée aux gènes de classe III en conditions standard de croissance.

Parmi les gènes transcrits par l’ARN Pol II et occupés par Sub1, on retrouve les ARNsno (pour

small nucleolar), une trentaine de gènes codant pour des constituants de la paroi cellulaire, des

gènes d’histones et des gènes codant pour des composants nécessaires à la machinerie de traduction, dont notamment une cinquantaine de gènes spécifiant des protéines ribosomiques. De manière intéressante, ces gènes auxquels Sub1 est associé correspondent à des gènes importants pour la croissance cellulaire. Sub1 pourrait donc réguler directement la croissance cellulaire.

2.4.2 Sub1 stimule deux étapes de la transcription : l’initiation et la

réinitiation facilitée

Nous nous sommes ensuite intéressés à l’influence que Sub1 pouvait avoir sur la transcription par l’ARN Pol III in vitro et in vivo.

Pour cela, nous avons examiné l’effet de Sub1 sur un système de transcription reconstitué in

vitro avec des facteurs recombinants et l’ARN Pol III purifiée. L’ajout de la protéine Sub1

recombinante dans ce système de transcription conduit à la stimulation de la transcription spécifique

d’un gène d’ARNtTyr, d’un gène d’ARNtIleu et du gène RDN5 de l’ARNr 5S. Plus précisément, Sub1 est

capable de stimuler la transcription in vitro par l’ARN Pol III à deux étapes particulières : l’initiation et la réinitiation facilitée.

En effet, lorsque la transcription par l’ARN Pol III in vitro d’un ARN est limitée par l’absence d’un nucléotide dans le milieu réactionnel, la réinitiation n’a pas lieu et seule l’initiation de la transcription permet d’aboutir à la synthèse d’un oligomère. Dans ces expériences, l’ajout de Sub1 recombinant stimule la synthèse de cet oligomère, sans toutefois améliorer la sélection du site

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d’initiation : plusieurs transcrits de tailles différentes sont obtenus, correspondant à des sites d’initiation différents. De plus, des expériences de retard sur gel montrent qu’en présence de Sub1, la fixation de TFIIIC sur l’ADN augmente. Sub1 semble également permettre un meilleur recrutement de TFIIIB dans le complexe de préinitiation. Sub1 est donc capable de stimuler en particulier l’étape d’initiation de la transcription par l’ARN Pol III in vitro (figure 21).

Figure 21. Sub1 interagit directement avec TFIIIB et TFIIIC

Par ailleurs, Sub1 intervient également dans l’étape de réinitiation de la transcription par l’ARN Pol III. La transcription de gènes d’ARNt avec le système reconstitué in vitro avec les facteurs de transcription recombinants permet de réaliser à peine deux cycles de transcription tandis que celle obtenue avec la fraction B’’ (contenant Bdp1 partiellement purifié) permet d’en réaliser au moins 15. L’ajout de Sub1 dans le système composé des facteurs recombinant conduit à plus de 20 cycles de transcription : Sub1, de manière comparable à la fraction B’’, est capable de stimuler la réinitiation facilitée in vitro.

Sub1 pourrait stimuler la réinitiation en stabilisant les facteurs TFIIIC et TFIIIB sur les promoteurs des gènes (figure 22). Une fois que l’ARN Pol III termine la transcription et clive l’ARN transcrit, elle serait alors immédiatement recyclée et recrutée par les facteurs de transcription déjà stabilisés sur les promoteurs. La réinitiation facilitée serait ainsi stimulée.

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Plusieurs expériences nous montrent que Sub1 s’associe avec des composants de la machinerie de transcription. Des western-blot indiquent que Sub1 est présent dans la fraction partiellement purifiée B’’. Et des expériences de far-western montrent que Sub1 s’associe non seulement avec la sous-unité Bdp1 de TFIIIB et les sous-unités τ95 et τ138 de TFIIIC, mais également avec Sub1 lui-même, tout comme PC4 qui est capable de se dimériser (Kretzschmar et al., 1994 ; Werten et al., 1998a).

2.4.3 Sub1 est requis pour une transcription par l’ARN Pol III

optimale

Parallèlement à nos expériences réalisées in vitro, nous nous sommes intéressés au lien in

vivo entre Sub1 et la machinerie de transcription par l’ARN Pol III. Nous avons analysé l’effet de la

délétion de SUB1 sur la transcription par l’ARN Pol III dans des levures. Bien que l’inactivation de Sub1 n’affecte pas la quantité des ARN totaux des cellules, le marquage des ARN néosynthétisés au

tritium révèle que la transcription des ARNt diminue d’environ 40% dans la souche sub1 par rapport

à la souche sauvage. De plus, la transcription du gène SUP4 de l’ARNtTyr à partir d’extraits de la

souche sub1 est réduite par rapport à une transcription obtenue avec des extraits d’une souche

sauvage. De même, des expériences d’extension d’amorces (primer extension) réalisées à partir des ARN extraits des levures indiquent que la néosynthèse des ARNt est réduite d’environ 35% dans une souche délétée pour SUB1 comparée à une souche sauvage.

Enfin, nous avons étudié l’occupation des facteurs de transcription TFIIIB et TFIIIC sur deux gènes de classe III dans une souche sauvage et sub1. Les ChIP réalisées nous indiquent que dans une souche dépourvue de Sub1, le facteur TFIIIB est moins présent sur les gènes que dans une souche sauvage, alors que l’occupation de TFIIIC sur ces mêmes gènes reste inchangée. Ces résultats sont en accord avec les précédentes expériences in vitro qui montrent que Sub1 aiderait TFIIIC à recruter TFIIIB sur les gènes de classe III.

Sub1 est donc requis in vivo pour une transcription par l’ARN Pol III optimale.

2.4.4 Sub1 est-il impliqué dans la transcription par l’ARN Pol I ?

Etant donné que Sub1 est un régulateur bien étudié de la transcription par l’ARN Pol II et que nous l’avons caractérisé en tant qu’activateur de la transcription par l’ARN Pol III, nous pouvons nous demander si Sub1 est également impliqué dans la transcription par l’ARN Pol I. L’occupation du gène spécifiant l’ARNr 35S par Sub1 nous le suggère (figure S2 en annexe de l’article). Cependant, le marquage des ARN néosynthétisés nous montre que l’ARNr 5,8S est légèrement moins transcrit dans une souche dépourvue de Sub1, mais cette expérience ne nous permet pas de détecter une différence pour les ARNr 25S et 18S également transcrits par l’ARN Pol I. De plus, les expériences

d’extension d’amorce à partir d’ARN extraits d’une souche sub1 ne révèlent aucune variation de la

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impliqué dans la transcription par l’ARN Pol I mais ne permettent pas de préciser quel lien pourrait exister entre eux.

Dans cette étude, nous avons mis en évidence que la protéine Sub1, bien qu’elle ne soit pas essentielle, est requise pour une transcription par l’ARN Pol III optimale in vivo. Au cours de notre étude, nous nous sommes principalement intéressés à la fonction de Sub1 en phase exponentielle de croissance. Mais la transcription par l’ARN Pol III peut-elle être régulée via Sub1, dans d’autres conditions de croissance ? Cette question fait en partie l’objet du chapitre suivant.

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