b.2. Résultats des croissances des mutants hydrogénases sous pression

II.b.2.a. Croissances à 0,1 MPa

Dans un premier temps, nous voulions voir la croissance des mutants à pression atmosphé-rique (0,1 MPa) (figure 36).

Les souches T. barophilus sauvage et le mutant (T.b TERMP_00517), nous servent de témoin pour apprécier une croissance standard de T. barophilus, et constitue un élément de compa-raison avec les croissances obtenues pour les mutants ( mbh, co-mbh, shI, shII).

Fig e 36: C oi ance de m an h d og na e 0,1 MPa a ec e an o f e

Le o che di e pendan le i i de c oi ance : co-mbh (ble clai ), mbh (o ange), T moin TERMP_00517 ( o ge), hI (ma e), hII ( e ), T moin T. ba ophil WT (ble fonc )

* : e a d de c oi ance e dimin ion de la den i cell lai e po le m an mbh

A 0,1 MPa et en présence de soufre, le c i ance n emblable l en emble de m an e de m in , n b e e ne c i ance e nen ielle e n la ea a ein a alen de 12 h de c l e a ec ne c ncen a i n cell lai e finale che de 10⁷ cell/mL. A 0,1 MPa a ec f e, le c i ance de m an mbh e co-mbh n l g emen l faible , mai le a de c i ance n de 2,3 e 2,1 h e ec i emen ; e de 2,5 h la che a age. On e d nc di e e le c i ance n imilai e le diff en e che . Ce hi g amme e e i n a m h i e e a ec f e, le h d g na e d l e n en ainen a de diff ence ignifica i e e n en en a dan le d el emen de T.

barophilus.

Le c l e en e dan l hi g amme de d i e, sans soufre, n diff en e , la

c i ance e l len e. En effe le la ea e a ein e lemen a b de 36 h, c n e 12 h a ec f e dan le milie . En e anche i le d el emen e alen i, la c ncen a i n cell lai e finale e emblable celle b en e c demmen .

Ce che en en d nc n d el emen cell lai e ini ial l len en ab ence de f e, e a eignen finalemen le m me a de c i ance. Pa aille , la diff ence e d e ni emen a a am e f e, e n n a a m a i n , i e le m an en en ne c i ance d all e imilai e a m in .

Ce e b e a i n ne a li e a a m an mbh ( mbh). Ce cell le en en n em de la ence de 12 h, endan le el il n a a de d el emen , i la c i ance e e nen ielle mai l faible e la che a age e le a e m an .

Il semble que les deux clusters délétés de Mbh soient impliqués dans la croissance de T. à 0,1 MPa, en absence de soufre.

II.b.2.b. Croissances à 40 MPa et 70 MPa

Nous avons testé la croissance sous pression des mêmes souches afin de comparer, mais sur des temps plus courts: un suivi de croissance de 12 h avec des points de cinétique réalisés tous les 3 h. Un e l m in e ali ici, il agi de la che TERMP_00517, placé dans chaque incubateur pour toutes les croissances entreprises. Dan le ca a c ne c i ance n e b-tenue pour le témoin, la mani la i n n e a alable.

Rappelons que 40 MPa, correspond à la pression optimale de croissance de la souche T. baro-philus, e e 70 MPa e ne e i n a- imale. Le c i ance b en e 40 MPa,

efl en d nc n malemen le f nc i nnemen imal d m ab li me de T. barophilus,

e 70 MPa l in a de la e i n de 0,1 MPa, ne c ndi i n de e .

Fig e 37: C oi ance de m an h d og na e 40 MPa, a ec e an o f e

co-mbh (ble clai ), mbh (o ange), T moin TERMP_00517 ( o ge), hI (ma e), hII ( e )

Fig e 38: C oi ance de m an h d og na e 70 MPa, a ec e an o f e

co-mbh (ble clai ), mbh (o ange), T moin TERMP_00517 ( o ge), hI (ma e), hII ( e )

A 40 MPa et 70 MPa en présence et en absence de soufre, on observe une croissance du mutant TERMP_00517 (figure 37 et 38), présent dans toutes les manipulations sous pression que nous avons entreprises, il sert de témoin de croissance.

1,00E+05

Pour les deux pressions testées, en présence de soufre (figure 37), on remarque une crois-sance proche de celle du témoin pour les mutants des hydrogénases cytosoliques ( shI et

shII), et au contraire une croissance plus faible pour les hydrogénases membranaires ( mbh et co-mbh). En absence de soufre pour les deux pressions testées (figure 38), les mêmes conclusions peuvent être faites, les mutants hydrogénases cytosoliques présentent une crois-sance, même si le mutant shII (qui correspond au shI de P. furiosus) a une croissance plus faible que le mutant shI (qui correspond au shII de P. furiosus), et les mutants hydrogénases membranaires mbh et co-mbh, ont une croissance très faible à 40 MPa et 70 MPa sans soufre.

L’ hydrogénase membranaire Mbh a possiblement un rôle pour la croissance de T. barophilus, pour toutes les pressions testées, que ce soit l’optimum (40 MPa)

ou les conditions sub et supra-optimales (0,1 et 70 MPa). La différence notable est que pour la pression de 0,1 MPa, en présence de soufre, le mutant mbh n e a im ac , mai pour des plus fortes pressions de 40 et 70 MPa, le mutant a une croissance impactée avec et sans soufre. Il serait donc intéressant de voir le comportement du mutant de l h d g na e Mbx pour les différentes pressions. Mbx fonctionne peut être seulement en présence de soufre, pour de faible pression.

Alors que le mutant co-mbh présente une croissance non impactée à 0,1 MPa, on remarque que pour des pressions plus élévées, la présence de l h d g na e Mbh-Codh semble plus im-portante pour la croissance de T. barophilus.

Pour l h d g na e SHII, son absence ne semble pas importante à 0,1 MPa, pourtant pour des pressions plus élévées, notamment à 40 et 70 MPa sans soufre, son absence semble entrainer un défaut de croissance.

L h d g na e SHI ne semble pas quant à elle, avoir de rôle dans la croissance de la souche et ce pour toutes les conditions de pression et de soufre testées.

II.b.3. Résultats de la production d’hydrogène des mutants hydrogénases

De i i de la d c i n d H2 a le m an n ali a ch ma g a hie en ha e

ga e e. En a all le n i i de c i ance a effec . A cha e em , n d nc ali : ne me e de la d c i n d H2 e n l emen de cell le i e a fi e e c m e. De cin i e 12 h n d ab d ali e le m in e le m an ; mai a c ne d c i n de ga n ai d ec e, n a n d nc a gmen le em de cin i e, a ec la ali a i n de in de cin i e, a i d em 24 h. En ce i c nce ne l aj de f e dan le milie , n a n a alable ali de me e d m in ( TERMP_00517) a ec

ne c ncen a i n de 1 g/L de f e e an f e. Le l a de d c i n d H2 n d nn de meille l a a ec d f e dan le milie . Ce i e nnan i e la d c i n d h d g ne a le h d g na e , e fai n malemen an f e. N a n d nc ali ne gamme de f e (0 1,5 g/L), afin d imi e la an i de f e ili e . La an i de 0,5 g/L a ch i ie i elle d nnai le meille a de d c i n e le meille endemen cell lai e. Mai il e a n ce ai e de ali e , de me e de la d c i n d H2 e galemen d H2S le m in e l en emble de m an , a ec de an i de f e de 0, 0,5, 1 e 2 g/L. Dan n e mie em en i an le m me c le e i n a m h i e e i ible a la i e e i n (40 e 70 MPa).

P le m men la c ndi i n e e e n i i de c i ance e de d c i n d H2 d m in TERMP_00517 e de m an ( mbh, co-mbh, shI, shII e mbx) 72h, a ec f e (0,5 g/L), e i n a m h i e.

G a hi e 0,1 MPa a ec f e (figure 39)

Le l a b en m n en n l ge e a d de c i ance e de endemen cell lai e le m an mbx (figure 39). La c i ance de m in e de a e m an e emblable, ce l a e en acc d a ec la c den e c i ance b en e 0,1 MPa e a ec d f e (figure 36). Cela e e li e a le fai e l h d g na e la l im an e dan la c i ance an f e e Mbh, ce i e li e e le m an mbh en e n d fa de c i ance an f e mai a le a e m an ; e a ec f e, c e Mb i e l h d g na e la l im an e, ce i e li e a ec d f e, e l le m an mbx en e n d fa de c i ance. Ce h h e n en acc d a ec la g la i n d

m ab li me de l h d g ne a le f e.

En ce i c nce ne la d c i n d H2, celle-ci e ine i an e le m an mbh e mbx.

Une d c i n d H2 (de 0h 72h) e mi e en idence le m in, shI, shII et co-mbh ( d c i n l faible) (figure 39); cela e e li e a ne d c i n ba ale d H2,

e - e d i e a l h d g na e Mbh. Mai dan ce ca le m an mbx, de ai galemen d i e ne an i emblable d h d g ne, ce i n e a le ca ici. De l n malemen en ence de f e, c e ne d c i n d H2S i e me en lace, a l ac i a i n de Mb . Mai c mme n mme ici dan ne c ndi i n de e i n b- imale e e e le m ab li me f nc i nne diff emen en ai n de ce e .

Fig e 39: Po cen age de p od c ion d'h d og ne pa le m an e i i de le c oi ance T moin TERMP_00517 ( o ge) co-mbh (ble clai ), mbh (o ange), , hI (ma e), hII ( e ),

mb (ma on)

II.b.4. Discussion et conclusion de l’étude

II.b.4.a. Croissance des mutants hydrogénases et production d’H2 à 0,1MPa

En fonction des conditions de culture avec/sans soufre, chez de nombreuses Thermococcales, un shift a été mis en évidence. Sans soufre les hydrogénases Mbh, SHI et SHII permettent la d c i n d h d g ne. Un hif a ide, de el e min e , e produit quand du soufre est aj en fa e de h d g na e im li e dan la f ma i n d H2S, notamment Mbx. La réponse serait contrôlée par le régulateur transcriptionnel SurR (Li c mb e al., 2009).

Sans soufre

En absence de soufre, la croissance est ralentie et diminuée pour le mutant mbh. Mbh e l h d g na e memb anai e inci ale i e me la d c i n d H2. Il semble que les deux clusters mbh délétés chez le mutant mbh soient impliqués dans la croissance de T.

barophilus à 0,1 MPa en absence de soufre. De précédentes études n m n l im ance des Mbh chez les Thermococcales (P. furiosus (Sa a e al., 2000, 2003), T. kodakarensis (Kanai e al., 2005; San angel e al., 2011)) pour le développement en absence de soufre (pas de c i ance e d c i n dimin e d h d g ne). Par exemple le mutant TSS1103 (délété pour Mbh TK2080-2093) de T. kodakarensis (San angel e al., 2011) où Mbh est indi en able la d c i n d H2 et pour une croissance sans soufre. Chez P. furiosus, des mutants mbhL, SHI/SHII, SHI/SHII/mbhL ont été réalisés (Sch e al., 2012), en absence de soufre il a été monré que les mutants mbhL et SHI/SHII/mbhL ne présentaient pas de croissance, par contre le mutant SHI/SHII a une croissance similaire au témoin ; et en présence de soufre, une croissance semblable pour toutes les souches est obtenue. Ce qui confirme le rôle de Mbh dans la croissance en absence de soufre et le fait que la compensation par les hydrogénases cytosoliques en ce qui concerne la croissance cellulaire ne soit pas possible; l in e e e an ai.

Comme chez T. kodakarensis et P. furiosus, nos résultats suggèrent le rôle important de lhydrogénase Mbh e iblemen n le dan l ada a i n de T. barophilus quand la pression est sub-optimale. Aucune autre hydrogénase fonctionnant sans soufre ne semble prendre le relais et compenser la perte de mbh.

En ce i c nce ne la d c i n d H2, le mutant TSS1103 de T. kodakarensis ne produit pas d H2 sans soufre (San angel e al., 2011), le même constat a été fait chez P. furious (Sch e al., 2012) où sans soufre dans le milieu, les mutants de délétion mbhL/SHI/SHII et mbhL ne d i en a d h d g ne a c n e le m an SHI/SHII d i ne an i d H2 compa-rable au témoin. Il e ai in e an de e e la d c i n d H2 du mutant mbh de T. baro-philus, les tests sont à refaire avec soufre mais surtout en condition sans soufre.

Chez T. barophilus, l de de Mbh n e me donc de conclure de son importance dans la culture sans soufre, puisque un retard de croissance est observé pour le mutant mbh. Cepen-dan l im ance che d a e Thermococcales comme P. furiosus et T. kodakarensis semble plus marquée, i a c ne c i ance n e b e e quand Mbh est délété, et la production d H2 est inexistante chez ces souches mutées (San angel e al., 2011; Sch e al., 2012).

L de de a e c m l e a ne de de la d c i n d H2 des souches mutées sans soufre et à pression atmosphérique, notamment de mbh, et si possible des mutants mbh/shI, mbh/shII, voir mbh/shI/shII afin de ifie i le me e de la d c i n d H2 par Mbh con-firment son importance et sont similaires a de ali e che d a e Thermococcales.

Il est également important de noter que 0,1 MPa, n e a la e i n optimale de la souche, n n d nc e e Mbh en l de n le dan le m ab li me de l H2 en ab-sence de soufre, semble a i n le dan l ada a i n a ba e e i n .

Les mutants shI et shII ne présentent pas de retard de croissance, la croissance est équivalente à celle du témoin à 0,1 MPa, sans soufre. Ce qui confirme les premières hypothèses quant à l im ance de l h d g na e memb anai e Mbh et le rôle secondaire des hydrogénases cytosoliques. Chez P. furiosus aucune des de en me n e indi en able pour la viabilité (Li c mb e al., 2011). De m an de h d g na e c li e de P.

furiosus : SHI e SHII, n ali (Li c mb e al., 2011). A c ne diff ence de c i ance n a m n e dan le c ndi i n e e (a ec/ an f e). Le m an de d l i n SHI/SHII, mbhL/SHI/SHII e d m an mbhL e n a n d c i c demmen

m n en e la d c i n d H2 n e a ali e a ce de h d g nae c li e che P. furiosus (Sch e al., 2012).

De de c m l men ai e afin de e e l ac i i de h d g na e dan le c la me n ali e (Sch e al., 2012), le m an SHI, SHII e le d ble m an SHI/SHII.

L ac i i n e a affec e le m an SHII, a c n e le m an SHI l ac i i e l faible (10%) e le d ble m an a d ac i i d ec e. Ce i c nfi me e la maj i de l ac i i de h d g na e c la mi e e d e SHI e e Mbh in e ien inci alemen a ni ea de la memb ane (Sa a e al., 2000; Sil a e al., 2000). Dan n e de SHI e SHII n e ec i emen la SHII e la SHI de P. furiosus, e m me i le ac i i e ec i e n a a e e, n e SHII e bea c l e im e e SHI, el n le d nn e

an c i mi e , e en acc d a ec ce i e b en che P. furiosus.

Chez T. kodakarensis un seul homologue sulfhydrogénase a été découvert (TK2069-72) (F k i e al., 2005). Le mutant construit croit au même taux que le témoin dans un milieu avec du soufre et sans soufre, mais la densité cellulaire finale est plus faible pour le mutant. En dépit de la plus faible den i cell lai e, la d c i n d H2 est plus importante pour le mutant que pour la souche sauvage. Une explication serait que le mutant SHI est incapable de consommer l H2 produit par Mbh (San angel e al., 2011).

Les résultats à 0,1 MPa sur les hydrogénases cytosoliques de T. barophilus, nous donnent des informations similaires aux autres Thermococcales. Elles ne sont pas indispensables à la

crois-ance ni la d c i n d H2. Cependant si on se réfère aux études transcriptomiques chez T.

barophilus et P. yayanosii, il a été montré que ces s lfh d g na e a aien n ni ea d e -pression qui variait pour de basses -pressions. Chez T. barophilus, une sur-ex-pression des gènes codant pour les hydrogénases cytosoliques à 0,1 et 70 MPa, et pour P. yayanosii une sous-expression de celles-ci, pour de faibles et hautes pressions. Or dans notre étude les sulfhydro-génases ne semblent pas impliquées dans la croissance pour de faibles pressions (0,1 MPa).

En ce qui concerne le mutant mbx, réaliser une croissance sans soufre de ce mutant est à envisager. Le résultat attendu de la délétion de cette hydrogénase, and il n a a de f e

serait une croissance non impactée. Ce qui confirmerait que son activité est naturellement inhibée par le régulateur SurR quand le soufre est absent. Des mutants de délétions de l h d -génase Mbx (TS1105) ont été réalisés chez T. kodakarensis (San angel e al., 2011), la crois-sance du mutant sans soufre est identique à celle du témoin, et il en est de même pour la pro-d c i n pro-d h pro-drogène. Une étupro-de pro-de pro-délétion pro-de mbx a également était réalisée chez P. furiosus (B idge e al., 2011) qui ne montre pas de différence de croissance en absence de soufre, mais le l a a en l in e an en ence de f e ce e n all n e par la suite. Réaliser ces croissances sans soufre à 0,1 MPa chez T. barophilus permettrait un

com-l men d inf ma i n, mai com-l de de ce m an e e lus enrichissante en présence de soufre.

Les études transcriptomiques chez P. yayanosii, ont montré que mbx était sur-exprimée pour des stress de pression, mai ceci n e a ai che T. barophilus, il n a pas de changement de lexpression de mbx à 0,1 MPa et 70 MPa. Les résultats de transcriptomiques sont tout de même à nuancer, i elle n ali e en ence de f e, e ce e -expression des gènes mbx chez P. yayanosii peut également être liée à ce facteur soufre ; ainsi réaliser les de de an c i mi e an f e e me ai de ifie elle e la a de l infl ence du soufre dans ces résultats de transcriptomiques (Mich d, 2014; Mich d and Jebba , 2016). Pour le moment un retard de croissance et un rendement cellulaire légérement plus faible du mutant à 0,1 MPa et avec soufre, ont été observés, mais il serait intéressant de refaire un suivi de croissance de mbx aux différentes pressions, pour voir si loxidoréductase Mbx permet une croissance sous pression.

Avec soufre

En présence de soufre, une croissance est observée pour les mutants mbh, co-mbh, shI, shII. Ces hydrogénases pour cette pression et avec soufre, ne semblent pas nécessaires à la croissance de la souche. L h h e a e ar la littérature serait que Mbx assure la croissance en présence de soufre dans le milieu. Mbx est un homologue de la sous unité du c m le e Mbh. L e e i n de ce n e a idemen e en iblemen a gmen e a la

présence de soufre. Le complexe Mbx remplace fonctionnellement le complexe Mbh quand du soufre est disponible (Ch e al., 2007; Sch e al., 2007). Il e n e ne faible mai d ec able an i d H2 e d i e a e le che c n enan l n mbh ( a f

mbx) and d f e e en , ce i e e c mme le ni ea d e e i n ba al de Mbh (San angel e al., 2011).

L de de la croissance du mutant mbx permettrait de voir le comportement du mutant en présence et en absence de soufre. En se référant à la littérature en présence de soufre, on

pour-ai a end e ne c i ance l fpour-aible i a de croissance pour ce mutant mbx, étant d nn e c e l h d g na e i f nc i nne a ec du soufre (nos premiers résultats de suivi de croissance de mbx avec soufre, montrent un retard de croissance et un rendement cellu-laire légérement plus faible).

Chez T. kodakarensis, un mutant de délétion mbx (TS1105) (TK1214-1226), a été construit.

Avec du soufre dans le milieu la souche pousse plus lentement et la densité cellulaire et 25%

moins importante que celle du témoin (San angel e al., 2011). Dans un milieu sans soufre, la croissance du mutant mbx e la d c i n d H2 est la même que pour la souche témoin (T.

kodakarensis), ce i e e l e e i n de Mbh est suffisante pour les réoxydations de cofacteur.

Des mutants de délétions ont également été obtenus chez P. furiosus (B idge e al., 2011), la délétion de mbxL en présence de soufre, a entrainé un défaut de croissance mais la délétion de cette hydrogénase n e a l hale contrairement à n h m l g e Mbh. L h h e e en présence de s f e d a e m cani me in e iennen .

En ce i c nce ne la d c i n d H2S, les études de délétion de certaines hydrogénases ont permis de rendre compte que ni Mbh, ni SHI, ni SHII ne sont responsable de la production d H2S. Che P. furiosus (Sch e al., 2012) la d c i n de ga a ali e, le d ble m an SHI/SHII e SHI/SHII/mbhL ain i e le m an mbhL, diff en e an i de f e ( an f e, 0,5 g/L e 2 g/L). En ce i c nce ne la d c i n d H2S a c ne d c i n n e b e e, en c ndi i n an f e. Mai le a e c ndi i n (0,5 g/L e 2 g/L) il a d c i n d H2S e le che e e , le ale n a i

i alen e .

Cependant le mutant de mbx, mbxL a montré une d c i n d H2S en présence de soufre, ce i gg e e d a es mécanismes soient impliqués dans la réduction du soufre (B idge e al., 2011).

L de d m an mbx serait intéressante afin de comparer à la littérature, ce qui se passe chez T. barophilus and d f e e en en e me de c i ance e de d c i n d H2S de ce mutant mbx.

De l c mme n lavons évoqué un peu plus haut, Mbx est sur-exprimée chez P. yayanosii en condition de hautes et basses pressions, ce qui suggère peut être un rôle de cette oxydoré-d c a e oxydoré-dan l aoxydoré-da a i n la e i n, mai e le de de anc i mi e n ali-sées avec du soufre, le doute de son infl ence dan ce e de n e t pas à écarter, i n le sait Mbx est activé en presence de soufre. Les cultures du muant mbx avec et sans soufre et pour les différentes conditions de pression, permettraien d a e de éléments de réponses complémentaires. Si par exemple à 0,1 MPa et 70 MPa, en condition de soufre et sans soufre, on obtient un retard de croissance du mutant mbx, i n e a b e 40 MPa, cela c n-firmerait les données de transcriptomique.

En ce i c nce ne le me e de la d c i n d H2 l 0,1 MPa, afin de c m l e l de, il e ai in e an de ali e :

Un i i de c i ance, d age d H2S e H2 en ence de f e:

Refai e ce e c i ance de m an a ec la m me an i de f e (0,5 g/L), mai galemen en ali an ne gamme f e (0,5 g/L, 1g/L e 2g/L i n de an i de f e e e dan la li a e).

Fai e le d age d h d g ne en a all le a ch ma g a hie en ha e ga e e.

Mai a i ifie la d c i n d H2S (la d ec i n a le mic -GC ne e me a de me e l H2S, e e a ec n d age c l im i e), i e en ence de f e, le m ab li me en fa e de la d c i n d H2S e fa i . Cela e li ne le e d inhibi i n d c m le e Mb d fai de la d g la i n d g la e S R e a

c n ai e ne e e d ac i a i n de h d g na e d c ice d H2.

Enfin le fai de fai e ne gamme de f e e me ai de i i la an i de f e a ne infl ence la d c i n d H2S. Le d c i n d H2S n -elle f e d endan e ?

Un i i de c i ance, d age d H2S e H2 en ab ence de f e:

Fai e ne c i ance de m an en ab ence de f e dan le milie , de ai n a e l d inf ma i n la d c i n d H2 en f nc i n de d l i n en e i e . En e f an a i i de c i ance ali c demmen , le m an n ne c i ance emblable a m in, a f le m an mbh i an f e en e n e a d de c i ance; ce i c nfi me l im ance de ce e h d g na e memb anai e. Dan le c ncl i n c den e Mbh emblai allie e e me e la

Fai e ne c i ance de m an en ab ence de f e dan le milie , de ai n a e l d inf ma i n la d c i n d H2 en f nc i n de d l i n en e i e . En e f an a i i de c i ance ali c demmen , le m an n ne c i ance emblable a m in, a f le m an mbh i an f e en e n e a d de c i ance; ce i c nfi me l im ance de ce e h d g na e memb anai e. Dan le c ncl i n c den e Mbh emblai allie e e me e la