L’IL-7R et α2β1 sont coexprimés sur les lymphocytes humains polarisés
Th17.
Nous avons d’abord examiné l’expression de l’IL-7Rα et de la chaîne α2 intégrine sur des lymphocytes humains polarisés Th17. L’expérience de cytométrie en flux démontre qu’une proportion élevée de lymphocytes expriment à la fois l’IL-7R et l’intégrine α2. (Figure 1) Nous avons donc évalué si ces deux récepteurs étaient également coexprimés chez les cellules productrices d’IL-17. Pour ce faire, les cellules furent stimulées avec PMA et ionomycine pendant six heures afin de capturer la production d’IL-17, puis l’expression de l’IL-7R et de l’intégrine α2 fut mesurée sur ces cellules (Fig 1). Il est à noter que la stimulation par le PMA+ionomycin ne modifie pas l’expression de chacun de ces deux récepteurs sur les lymphocytes T [137]. La vaste majorité des cellules productrices d’IL-17 (Th17) expriment à la fois l’IL-7R et l’intégrine α2 (Fig 1A). Une analyse de l’expression de ces récepteurs sur cinq donneurs différents indique qu’entre 69% et 95% des lymphocytes Th17 sont positifs pour les deux récepteurs (Fig 1B). Tel qu’attendu, presque toutes les cellules exprimaient la chaîne β1 des intégrines, qui s’associe à la chaine α2 pour former l’intégrine α2β1. Ces résultats démontrent que les lymphocytes Th17 coexpriment l’IL-7R et l’intégrine α2β1.
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Figure 1 : L’IL-7R et l’intégrine α2β1 sont coexprimés sur les lymphocytes Th17 humains.
(A) Expression de l’IL-7R/α2β1 sur des lymphocytes humains polarisés Th17. Les cellules furent marquées avec un
anticorps anti-intégrine α2-PE et anti-IL-7R-Alexa 488, puis analysées par cytométrie de flux. (B) Association entre l’IL- 7R/α2β1 et les lymphocytes Th17. Les cellules humaines polarisées Th17 furent restimulées avec PMA/ionomycine en présence de Brefeldin A. Les cellules furent lavées puis marquées avec un anticorps anti-intrégrine α2-PE et anti-IL-7R- Alexa 488. Les cellules furent ensuite lavées, fixées/perméabilisées, puis marquées avec un anticorps anti-IL-17-Alexa 647 pour détecter l’IL-17 intracellulaire. Les cellules furent analysées par cytométrie de flux. Afin de déterminer les pourcentages de Th17 double positifs, les cellules IL-17+ furent d’abord sélectionnées, et l’analyse FACS fut conduite sur ces dernières. Les profils de cytométrie de flux sont représentatifs de cinq donneurs différents. L’histogramme représente les pourcentages de cellules coexprimant l’intégrine α2β1 et l’IL-7R sur les Th17 polarisés à partir de lymphocytes T provenant du sang périphérique de cinq donneurs différents.
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La liaison d’IL-7R et de l’intégrine α2β1 par leur ligand active les
lymphocytes Th17 humains.
Afin de déterminer la capacité de l’IL-7 et du collagène à activer les lymphocytes Th17, les cellules furent cultivées sur une matrice de collagène, en absence ou présence d’IL-7, puis le nombre de cellules productrices d’IL-17 fut déterminé par cytométrie en flux. L’IL-7 et le collagène sont tous deux capables de stimuler la production d’IL-17 chez les lymphocytes Th17. De 4 à 5% des cellules devinrent productrices suite à chacun des stimuli (Fig 2A). De plus, une combinaison d’IL-7 et de collagène menait à la détection d’environ 12% de cellules productrices d’IL-17. L’analyse des Th17 sur cinq donneurs différents indiquent que l’IL-7 ou le collagène ont une capacité d’activation des Th17 égale et qu’une combinaison des deux amenait une production 2 à 3 fois plus élevée qu’avec un stimulus seul (Fig 2A). Des résultats similaires furent obtenus lorsque nous avons mesuré par ELISA la production d’IL-17 dans le surnageant des cultures cellulaires (Fig 2B). Ces résultats montrent que l’IL-7R et l’intégrine α2β1 ont coopéré de façon additive ou synergique pour augmenter la production d’IL-17 dans des lymphocytes Th17 humains.
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Figure 2 : Le collagène coopère avec l’IL-7 pour augmenter la production d’IL-17
(A) Des lymphocytes humains polarisés Th17 furent laissés non traités (NT) ou activés dans des puits contenant une
matrice de collagène I 10 µg/ml (Col), en présence ou absence d’IL-7 soluble (10 ng/ml) pendant douze heures, et ce en présence de Brefeldin A. Les cellules furent ensuite lavées, fixées/perméabilisées, puis marquées avec un anticorps anti- IL-17-Alexa 647 ou un anticorps contrôle isotypique, avant d’être analysées par cytométrie de flux. Le panneau de gauche représente un profil typique en cytométrie de flux et le panneau de droite représente les valeurs moyennes des cellules positives pour l’IL-17 de cinq expériences indépendantes, à partir de lymphocytes T provenant du sang péripherique de cinq donneurs différents (n=5). (B) Les niveaux d’IL-17 furent mesurés par ELISA dans des surnageants de Th17 activées par le collagène et l’IL-7 (n=5). Les données de (A; panneau de droite), (B), (C), (D) sont des valeurs moyennes +/- ESM. * p < 0.05 lorsque comparé aux échantillons NT. ** p < 0.05 lorsque comparé aux échantillons traités à l’IL-7 ou à Col.
La fibronectine n’a pas d’effet sur l’activation des lymphocytes Th17.
Puisque la fibronectine est également une composante importante de la matrice extracellulaire, nous avons comparé les effets de celle-ci avec ceux du collagène. Les résultats démontrent que le collagène peut induire une production d’IL-17 à partir de concentrations de 5 µg/ml et que son effet maximal est atteint à une concentration de 10-20 µg/ml (Fig 3A). La matrice de fibronectine n’avait au contraire aucun effet sur la
33 production d’IL-17, quelle que soit sa concentration et même en combinaison avec l’IL-7 (Fig 3B). Ces résultats indiquent un rôle majeur de la voie de signalisation du collagène via l’intégrine α2β1 dans les fonctions du Th17.
Figure 3 : La fibronectine n’a aucun effet sur l’activation des lymphocytes Th17.
(A) Le collagène (Col), mais pas la fibronectine (Fbn), induit la production d’IL-17 tel que mesuré par marquage
intracellulaire et cytométrie de flux (n=5). (B) La fibronectine n’augmente pas la production d’IL-17 induite par l’IL-7 dans des cellules Th17 humaines (n=5). Les données de (A) et (B) sont des valeurs moyennes +/- ESM. * p < 0.05 lorsque comparé aux échantillons NT ou traités à Fbn. ** p < 0.05 lorsque comparé aux échantillons traités à l’IL-7 ou à Col.
La liaison d’IL-7R et de l’intégrine α2β1 par leur ligand augmente
également la production d’IFN-γ par les lymphocytes Th17 humains.
Les Th17 ont également la capacité de produire d’autres cytokines pro-inflammatoires, tel que l’IFN-γ. Nous avons donc investigué si la coopération fonctionnelle entre l’intégrine α2β1 et l’IL-7R se limitait à l’IL-17 en étudiant la capacité de ces deux récepteurs à augmenter la production d’IFN- γ chez les lymphocytes Th17 humains. L’IL-7 et le collagène sont tous deux capables de stimuler la production d’IL-17 chez les lymphocytes Th17. Environ 10% des cellules devinrent productrices d’IFN- γ suite à chacun des stimuli (Fig 4A). De plus, une combinaison d’IL-7 et de collagène menait à la détection de 25-30% de cellules productrices (Fig 4A). La coopération fonctionnelle entre l’intégrine α2β1 et l’IL-7R peut donc mener à la production d’autres cytokines que l’IL-17, tel que l’IFN-γ.
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Figure 4 : Le collagène coopère avec l’IL-7 pour augmenter la production d’IFN-γ.
(A) Des lymphocytes humains polarisés Th17 furent laissés non traités (NT) ou activés dans des puits contenant une
matrice de collagène I 10 µg/ml (Col), en présence ou absence d’IL-7 soluble (10 ng/ml) pendant douze heures, et ce en présence de Brefeldin A. Les cellules furent ensuite lavées, fixées/perméabilisées, puis marquées avec un anticorps anti- IFN-γ-PE ou un anticorps contrôle isotypique, avant d’être analysées par cytométrie de flux. Le graphique représente les valeurs moyennes des cellules positives pour l’IL-17 de cinq expériences indépendantes, à partir de lymphocytes T provenant du sang périphérique de quatre donneurs différents (n=4). Les données sont des valeurs moyennes +/- ESM. * p < 0.05 lorsque comparé aux échantillons NT. ** p < 0.05 lorsque comparé aux échantillons traités à l’IL-7 ou à Col.
L’IL-7R et l’intégrine α2β1 augmentent la production d’IL-17 via
JAK/STAT5 et MAPK/ERK, respectivement.
Afin de déterminer les mécanismes intracellulaires par lesquels l’IL-7R et α2β1 coopèrent pour activer les Th17, nous avons étudié les voies de signalisation activées par ces deux récepteurs. Le récepteur de l’IL-7 est associé aux voies de JAK/STAT et de PI3K/AKT [91] et il a déjà été démontré que STAT5 est l’isoforme majeur activé par l’IL-7 dans les lymphocytes T mémoires ou effecteurs. [91] L’intégrine α2β1 et le collagène ont tous deux également la capacité d’activer les voies des MAPK/ERK et de PI3K/AKT [137]. Nous avons examiné la contribution de ces voies à l’aide d’inhibiteurs spécifiques à chacune de ces voies.
35 Le traitement des lymphocytes T humains polarisés Th17 avec des inhibiteurs dirigés contre JAK (pan-JAK) et contre PI3K (wortmanin) réduisait le nombre de cellules productrices d’IL-17 dans les cellules traitées à l’IL-7, mais n’eut aucun effet sur la stimulation par le collagène (Fig 5A). L’utilisation d’un inhibiteur de MAPK/ERK (PD98059) diminuait plutôt la quantité de cellules productrices d’IL-17 dans les cellules activées par le collagène, mais n’affectait pas l’effet de l’IL-7 (Fig 5A).
L’activation de STAT5, de PI3K/AKT et de MAPK/ERK a ensuite été analysée par immunobuvardage. La stimulation par l’IL-7 induit la phosphorylation de STAT5 qui est légèrement diminuée par le collagène (Fig 5B). L’IL-7, seul ou combiné au collagène, augmentait la phosphorylation d’AKT. De plus, seul le collagène augmentait la phosphorylation d’ERK. Ces résultats suggèrent que la coopération fonctionnelle entre l’intégrine α2β1 et l’IL-7R implique l’interaction de nombreuses voies de signalisation.
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Figure 5 : Rôle des voies de signalisation JAK/STAT et MAPK/ERK dans la coopération fonctionnelle de l’intégrine α2β1 et de l’IL-7R.
(A) Les inhibiteurs de JAK, PI3K/AKT et MAPK/ERK annulent l’augmentation de la production d’IL-17 induite par l’IL-
7 et le collagène. Les lymphocytes humains polarisés Th17 furent pré-incubés pendant 1h avec ou sans le pan-JAK, la wortmanin ou le PD98059. Les cellules furent ensuite laissées non traitées (NT) ou stimulées sur une matrice de collagène (Col), avec de l’IL-7 soluble ou en présence de collagène et d’IL-7 (IL-7+Col) pendant douze heures. Dans tous les cas, les cellules étaient en présence de Brefeldin A. Les cellules productrices d’IL-17 furent mesurées à l’aide d’un marquage intracellulaire et par cytométrie de flux. Les valeurs moyennes +/- ESM proviennent de cinq expériences différentes (n=5). * p < 0.05 lorsque comparé aux valeurs des cellules contrôles sans inhibiteurs. (B) L’IL-7 et le collagène induisent l’activation de STAT5 (p-STAT5), AKT (p-AKT) et ERK (p-ERK). Les lymphocytes Th17 furent stimulés tel qu’indiqué pendant 60 minutes. Les cellules furent ensuite lavées puis lysées à l’aide d’un tampon RIPA. L’activation de STAT-5, AKT et ERK fut déterminée par immunobuvardage à l’aide d’anticorps spécifiques aux formes phosphorylées de ces
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protéines. Un deuxième sondage fut ensuite effectué avec des anticorps anti-β-actine, anti-AKT et anti-ERK2, tel qu’indiqué, pour assurer un chargement égal des puits. Les nombres indiqués sur chaque bande représentent l’analyse de densitométrie. Ils expriment la proportion de l’augmentation entre le p-STAT5 total et la β-actine, p-AKT et AKT total et p-ERK et ERK2. Les immunobuvardages présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes.
Chapitre IV : Discussion
Les lymphocytes Th17 sont bien connus pour leur rôle dans de nombreuses pathologies auto-inflammatoires, tels que le psoriasis et l’arthrite rhumatoïde. Or, les mécanismes régissant leur activation et la production d’IL-17 sont encore mal compris. Certaines études indiquent qu’en milieu inflammatoire chronique, la signalisation du TCR est défectueuse. Il est donc primordial d’investiguer d’autres voies possibles afin de comprendre comment les lymphocytes Th17 s’activent.
Nous avons démontré que l’intégrine α2β1 et l’IL-7R sont coexprimés sur les lymphocytes Th17 humains (Figure 1). Les lymphocytes Th17 utilisés dans cette étude ont un phénotype mémoire (CD45RA-CD45RO+), connu pour exprimer un haut niveau d’IL-7R. De plus, l’intégrine α2β1 est associée aux cellules effectrices et aux cellules mémoires, mais pas aux lymphocytes T naïfs [110, 150]. L’expression de l’intégrine α2β1 et l’IL-7R sur les lymphocytes Th17 humains de cinq donneurs différents correspond donc au profil d’expression des lymphocytes mémoires dans la littérature.
La liaison de chacun ces deux récepteurs avec leur ligand induit la production d’IL-17 et l’activation simultanée de l’intégrine α2β1 et de l’IL-7R mène à une augmentation additive de la production d’IL-17 (Figure 2). Ces résultats démontrent que les lymphocytes Th17 humains peuvent être activés autrement que par la liaison du TCR à l’antigène.
La fibronectine est une protéine importante de la matrice extracellulaire. Elle est capable d’augmenter faiblement la production d’IFN-γ chez des lymphocytes CD8+
d’abord activé par le CD3 [151]. Nos résultats indiquent toutefois que la fibronectine ne stimule pas les fonctions des Th17 (Figure 3). En effet, elle fut incapable d’induire la production d’IL-17, ou d’augmenter celle induite par l’IL-7. Le collagène serait donc la matrice la plus importante dans les fonctions du Th17 par le biais de sa liaison avec l’intégrine α2β1.
39 Afin de mieux expliquer la coopération fonctionnelle entre ces deux récepteurs, nous avons investigué les voies de signalisation nécessaires à l’induction de l’IL-17 par l’intégrine α2β1 et l’IL-7R. Les expériences de signalisation ont démontré que l’activation des lymphocytes Th17 reposait sur plusieurs voies de signalisation dont les interactions convergent pour augmenter la production d’IL-17. L’induction de l’IL-17 par l’IL-7 dépend des kinases JAK et de la voie de PI3K/AKT (Figure 5). La signalisation de l’intégrine α2β1 passe plutôt par les MAPK/ERK (Figure 5) et contribue potentiellement à l’effet de l’IL-7 en réduisant la phosphorylation de STAT5, qui peut être un régulateur négatif de l’IL-17 [137]. (Schéma 3) La fibronectine est incapable d’activer la voie des MAPK/ERK de façon soutenue [142], ce qui explique pourquoi l’intégrine α2β1 mais pas la fibronectine pouvait augmenter la production d’IL-17.
Schéma 5 : Modèle de signalisation dans la coopération fonctionnelle entre l’intégrine α2β1 et l’IL-7R.
Certaines études ont montré que des inhibiteurs de MAPK/ERK freinaient le développement des Th17 et atténuaient les colites [152] et l’EAE [153], ce qui vient
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appuyer l’implication de MAPK/ERK dans la signalisation. La voie de PI3K/AKT a, quant à elle, déjà été associée avec le développement des Th17 [154] et l’expression de l’IL-17 dans des lymphocytes T mémoires CCR6+ [155]. Les voies de MAPK/ERK et de PI3K/AKT pourraient donc devenir de bonnes cibles thérapeutiques pour diminuer la production d’IL-17 dans des maladies inflammatoires chroniques telle que l’arthrite rhumatoïde.
La coopération fonctionnelle entre l’intégrine α2β1 et l’IL-7R pourrait également provenir d’une augmentation de l’adhésion au collagène suite à la stimulation par l’IL-7 des cellules. Des études précédentes ont d’ailleurs déjà démontré que l’IL-7 peut augmenter l’adhésion des lymphocytes T à la MEC [156] et que, lors d’un sepsis, l’IL-7 améliore également leur adhésion à l’endothélium via LFA-1 [157]. Il serait donc important d’étudier la possibilité que l’IL-7 augmente l’adhésion des Th17 au collagène.
La capacité de l’intégrine α2β1 et de l’IL-7R à augmenter la production d’IL-17 suggère que ces récepteurs peuvent également moduler la production d’autres cytokines. Les Th17 peuvent également produire de l’IFN-γ [51] et la cytokine ostéoclastogénique RANKL [68]. Il a d’ailleurs déjà été démontré que l’intrégine α2β1 pouvait augmenter la production d’IFN-γ dépendante du TCR [10]. Nous avons aussi établi que l’activation de l’intégrine α2β1 et l’IL-7R augmentaient la production d’IFN-γ par les Th17, et ce de manière synergique (Figure 4). Cela suggère que la coopération entre l’intégrine α2β1 et l’IL-7R n’est pas spécifique qu’au Th17, mais peut se retrouver également dans les Th1, qui sont également connus pour être impliqués dans les maladies inflammatoires.
De plus, nous n’avons pas exploré dans le cadre de cette étude les synergies potentielles entre l’IL-7R et l’intégrine α2β1 sur d’autres fonctions ou voies d’activation des Th17, telles que celles des facteurs de croissance. En effet, nous savons déjà que les intégrines coopèrent avec ces derniers pour maintenir les cellules en vie [121]. L’IL-7R étant également impliqué dans la survie des cellules, rien n’exclut une coopération entre ce récepteur et les intégrines dans l’activation des voies de stimulation en aval des facteurs de croissance.
41 Nous avons déjà démontré que le blocage de l’intégrine α2β1 réduisait le développement de l’arthrite induite par le collagène chez les souris, et ce en inhibant les fonctions des Th17 [150]. De plus, des anticorps bloquant l’IL-7 ou son récepteur diminuent le développement de l’arthrite dans des modèles murins [105, 106]. Les résultats in vitro de cette étude se traduisent également dans un modèle in vivo et font partie d’une publication. En effet, le blocage de l’intégrine α2β1 diminue la capacité de l’IL-7 à induire la perte osseuse chez la souris en bloquant la production de l’IL-17 [158].
Approfondir les mécanismes par lesquels l’intégrine α2β1 et l’IL-7R activent les Th17 dans un contexte de maladie inflammatoire chronique permettrait de mieux comprendre le rôle critique de ces récepteurs dans la phase effectrice de ces lymphocytes et leur contribution à la pathogénie de la maladie. Ces connaissances pourraient mener au développement de nouvelles avenues thérapeutiques.
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