Résultats complémentaires

La leucocine KM432Bz est active contre des bactéries à Gram positif

phylogénétiquement proches avec des CMI comprises entre 0,08 nM et 10 µM. La leucocine KM432Bz est également active contre des pathogènes telles que Li.

monocytogenes pour laquelle elle présente une CMI de 156 nM. En revanche, elle est

inactive contre toutes les bactéries à Gram négatif testées. Enfin, la leucocine KM432Bz exerce par ailleurs, un effet bactéricide sur la croissance de Lb. sakei subsp. sakei et un effet bactériostatique sur Li. monocytogenes.

III. Résultats complémentaires

III.1. Caractérisation de la leucocine KM432Bz

Afn de démontrer que laleucocine KM432Bz de masse moléculaire 3930 Da possède une activité antimicrobienne anti-Listeria, nous avons réalisé un « gel overlay ». Le gel Tris-tricine-SDS a été soumis à une électrophorèse puis découpé en deux parties. Une partie a été colorée au bleu de Coomassie G-250 et au nitrate d’argent et une autre a été soumise à un test antimicrobien.

Après coloration, aucune bande correspondant à la bactériocine KM432Bz n’a été obtenue. En revanche, la partie du gel soumise au test antimicrobien sur Li. monocytogenes CIP 80.110 a révélé un halo d’inhibition correspondant à une masse moléculaire comprise entre 1,7 et 4,6 kDa (Figure II. 4).

Le peptide de masse moléculaire 3930 Da présente une activité antimicrobienne dirigée contre Li. monocytogenes CIP 80.110.

kDa

40,0

25,0

15,0

10,0

-1 2

1,7

4,6

-kDa

40,0

25,0

15,0

10,0

-1 2

1,7

4,6

-Figure II. 4. Electrophorèse Tris-tricine-SDS de la bactériocine KM432Bz. La piste 1

représente le marqueur précoloré de masses moléculaires (1.7
40 kDa, Fermentas). La

piste 2 représente l’activité antimicrobienne contre Li. monocytogenes CIP 80.110. La flèche rouge indique le halo d’inhibition.

III.2. Implication de EII^tMan dans le mode d’action de la leucocine KM432Bz

Des études ont montré que l’inactivation du gène rpoN codant le facteur de transcription σ54 induisait la résistance de Li. monocytogenes à la mésentéricine Y105

(Robichon et al., 1997). σ⁵⁴ est un facteur de transcription qui active l’expression du gène codant une mannose perméase du système des phosphotransférases EII^t_Man. Ce résultat suggére que EII^tMan pourrait jouer le rôle de récepteur pour la mésentéricine Y105 lors du contact avec la membrane cytoplasmique de la bactérie cible (Dalet et al., 2001). Afin de vérifier le rôle de EII^tMan dans le mode d’action de la leucocine KM432Bz, nous avons testé l’activité antimicrobienne de la leucocine KM432Bz sur la souche de Li. monocytogenes inactivée pour le gène rpoN (rpoN ^-) codant σ⁵⁴. Les mutants, générés par insertion d’un fragment nucléotidique de 1559 pb correspondant à la jonction Tn917–lac/ rpoNdu plasmide pRT758 dans le gène rpoN (Dalet et al., 2001, Robichon et al., 1997), nous ont été aimablement forunis par le Professeur Yan Héchard (Université de Poitiers). Un contrôle positif a été réalisé en testant parrallèlement la leucocine KM432Bz sur la souche Li. monocytogenes sauvage (rpoN

+ ).

Des tests antimicrobiens de la leucocine KM432Bz contre les deux souches ont révélé que la souche rpoN⁺ était sensible à la leucocine KM432Bz alors que la souche rpoN^- était résistante (Figure II. 5). Ce résultat suggère que la leucocine KM432Bz utiliserait le même récepteur membranaire que la mésentéricine Y105 afin d’interagir avec la membrane cytoplasmique de la bactérie cible. La mutation du gène rpoN engendre la résistance des bactéries naturellement sensibles aux bactériocines de classe IIa, y compris à la leucocine KM432Bz.

A B

10 mm

A B

10 mm

Figure II. 5. Tests antimicrobiens de la leucocine KM432Bz (5 µl , 10 µM) sur Li.

monocytogenes EGDE rpoN

+

(A) et rpoN

(B).

III.3. Effet de la leucocine KM432Bz sur des biofilms

Un biofilm est formé de différents microorganismes vivants et morts adhérant entre eux et à une surface, englués dans une matrice adhésive et protectrice composée essentiellement de protéines, glycoprotéines, polysaccharides, de sels et d’eau. Selon les conditions environnementales, les biofilms peuvent s’organiser en couche monocellulaire ou devenir plus complexes et comporter des couches formées par différents microorganismes (Hall-Stoodley et al., 2004). Les biofilms offrent une véritable protection pour les bactéries aboutissant ainsi à l’émergence de nombreuses résistances aux traitements physiques et chimiques conventionnels.

Les problèmes liés aux biofilms concernent différents domaines parmi lesquels la santé, le traitement des eaux, l’industrie agroalimentaire,… Dans le secteur alimentaire et en particulier laitier et fromager, la présence de biofilms formés par Li. monocytogenes (Wong, 1998) peut entraîner de sévères problèmes de santé publique (Carpentier et Cerf, 2011).

Dans ce contexte, nous avons examiné les capacités de la leucocine KM432Bz à inhiber les biofilms à deux niveaux, lors deleur formation et lorsqu’ils sont déjà constitués.

a. Effet de la leucocine KM432Bz sur la formation d’un biofilm

Afin d’étudier l’effet de la leucocine KM432Bz sur la formation de biofilm, les bactéries sensibles ont été cultivées en présence de bactériocine à 5 et 10 µM. Les puits contenant les cultures bactériennes ont ensuite été vidés, lavés puis colorés au Crystal violet. Les DO620nm ont été mesurées afin de quantifier le biofilm formé. Ce test a révélé que la leucocine KM432Bz aux concentrations 5 et 10 µ M inhibait la formation d’un biofilm par Lb. sakei subsp. sakei CIP 103139 et Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides CIP 102305. De plus, la bactériocine à la concentration 10 µM inhibait la formation d’un biofilm par Li. monocytogenes EGDE (Figure II. 6). En revanche, la leucocine KM432Bz n’a aucun effet réellement significatif sur la formation de biofilms par les autres bactéries qui lui sont sensibles, à savoir Li. monocytogenes CIP 80.110 et surtout Li. innocua CIP 80.11 qui y est totalement insensible (Figure II. 6).

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 1 2 3 4 5 D O 6 2 0 n m

Figure II. 6. Effet de la leucocine KM432Bz à 10 ( ) et 5 µM ( ) sur la formation d’un biofilm par Lb. sakei subsp. sakei CIP 103139 (1); Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides

CIP 102305 (2); Li. innocua CIP 80.11 (3); Li. monocytogenes CIP 80.110 (4) et Li. monocytogenes EGDE (5). Le contrôle sans bactériocine pour chaque bactérie est présenté en

sur les diagrammes.

b. Effet de la leucocine KM432Bz sur un biofilm préformé

contenant les cultures bactériennes ont ensuite été vidés, lavés puis colorés au Crystal violet. Les DO_620nm ont été mesurées afin de quantifier le biofilm formé. Seuls les biofilms formés par Lb. sakei subsp. sakei CIP 103139 et Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides CIP 102305 sont sensibles à l’effet antimicrobien de la leucocine KM432Bz à 5 et 10 µ M (Figure II. 7).

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 1 2 3 4 5 D O 6 2 0 n m

Figure II. 7. Effet de la leucocine KM432Bz à 10 ( ) et 5 µM ( ) sur un biofilm préfomé

par Lb. sakei subsp. sakei CIP 103139 (1); Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides CIP 102305 (2); Li. innocua CIP 80.11 (3); Li. monocytogenes CIP 80.110 (4) et Li. monocytogenes EGDE (5). Le contrôle sans bactériocine pour chaque bactérie est présenté en

sur les diagrammes.

La leucocine KM432Bz inhibe la formation de biofilms par deux souches

phylogénétiquement proches de la souche productrice à savoir Lb. sakei subsp. sakei CIP 103139 et Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides CIP 102305 ainsi que par un pathogène Li. monocytogenes CIP 80.110. En revanche, elle est seulement active contre les biofilms préformés par Lb. sakei subsp. sakei CIP 103139 et Ln. mesenteroides subsp.

mesenteroides CIP 102305.

III.4. Recherche du gène codant le précurseur de la leucocine KM432Bz chez d’autres espèces de Leuconostoc

Afin de vérifier la présence (ou non) du gène codant la précurseur de la leucocine KM432Bz chez d’autres espèces du genre Leuconostoc nous avons d’abord soumis quelques espèces de Leuconostoc à des tests antimicrobiens en utilisant la leucocine KM432Bz (5 µl,

10 µM) puis vérifié, par PCR, la présence ou l’absence du gène codant le précurseur de la bactériocine chez l’ensemble des espèces de Leuconostoc testées.

Le test antimicrobien révèle la résistance de trois espèces à savoir Ln. carnosum CIP 103319, Ln. citreum CIP 103315 et Ln. gelidum CIP 103318. Cette résistance semble montrer que ces espèces sont immunisées contre la leucocine KM432Bz. Par contre, la leucocine KM432Bz est inactive contre Ln. mesenteroides subsp. dextranicum CIP 102423, Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides CIP 102305 et Ln. pseudomesenteroides CIP 103316. La résistance de la souche productrice Ln. pseudomesenteroides KM432Bz à sa propre bactériocine confirme son immunité à sa propre production (Table 1, publication).

La recherche du gène codant le précurseur de la bactériocine chez ces différentes souches a été réalisée. Pour cela, un fragment du gène codant la leucocine KM432Bz a été amplifié par PCR en utilisant des amorce spécifiques (PréleuB-F et PréleuB-R, Table 2, publication) chez les différentes espèces de Leuconostoc y compris chez la bactérie productrice Ln. pseudomesenteroides (contrôle positif).

Toutes les bactéries testées montrent la présence d’un amplicon du fragment du gène codant le précurseur de la leucocine KM432Bz d’environ 178 pb (Figure II. 8).

Les bactéries immunisées à une bactériocine sont généralement porteuses d’un gène codant une protéine d’immunité à l’origine de cette résistance. Dans la plupart des cas, le gène codant la protéine d’immunité se trouve en aval du gène codant le précurseur de la bactériocine sur une même unité de transcription (Ennahar et al., 2000). Or, notre étude révèle que même les bactéries sensibles semblent porter le gène codant le précurseur de la bactériocine. Différentes hypothèses sont possibles : soit le gène codant le précurseur de la bactériocine est transféré seul, soit toute l’unité de transcription (gène codant le précurseur de la bactériocine + gène codant la protéine d’immunité) est tranférée mais pas exprimée chez la bactéries réceptrice (possibilité d’un promoteur différent ?).

500 pb 400 300 200 100

1 2 3 4 5 6 7 8

178 pb

1 2 3 4 5 6 7 8

178 pb

Figure II. 8. Gel d’agarose des produits PCR obtenu en utilisant des amorces spécifiques pour amplifier un fragment du gène codant le précurseur de la leucocine KM432Bz à

partir de matrices correspondant aux ADN génomiques de Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides CIP 102305 (1); Ln. carnosum CIP 103319 (2); Ln. mesenteroides subsp. dextranicum CIP 102423 (3); Ln. citreum CIP 103315 (4); Ln. pseudomesenteroides CIP 103316 (5); Ln. gelidum CIP 103318 (6); Ln. pseudomesenteroides KM432Bz (7, côntrole positif). La piste 8 correspond au marqueur de poids moléculaire 100 pb (NEB).

Discussion générale, conclusions et perspectives