Réponse immunitaire chez le veau

Dans les élevages, les veaux et les petits ruminants nouveau-nés sont très sensibles à l’infection par C. parvum. La maladie se caractérise le plus souvent par des diarrhées profuses, difficiles à maîtriser qui peuvent conduire à la mort de l’animal. Le coût des expérimentations sur veaux et le manque de réactifs immunologiques justifient que peu d’études caractérisant la réponse immunitaire chez le veau infecté par C. parvum soient réalisées.

Dès la naissance jusqu’à l’âge de 1 mois, le veau est très sensible à l’infection par

C. parvum. Chez des veaux infectés expérimentalement à l’âge de 2 semaines, l’excrétion

des oocystes commence 5 jours après l’inoculation et s’étend sur 5 jours. Dès le deuxième jour après l’inoculation, une prolifération des lymphocytes du sang périphérique spécifiques de C. parvum est observée, elle est maintenue pendant au moins 23 jours (fin de l’expérimentation). La réponse en anticorps sérique spécifique de C. parvum est détectée à partir de 7 jours p.i., elle est également maintenue au moins jusqu’à la fin de l’expérimentation (Whitmire et Harp, 1991). Cependant, comme chez la souris, la réponse en anticorps systémique reflète l’infection mais ne permet pas la protection de l’infection par C. parvum localisée dans l’intestin.

Peeters et al. ont montré que localement, la production d’IgM spécifiques commençait dès 5 jours p.i. pour diminuer vers le 15^ème jour après l’inoculation alors que la production d’IgG diminue vers 3 semaines p.i.. Ces mêmes auteurs ont montré que la production d’IgA fécales commençait un peu plus tardivement que celle des IgM et IgG pour atteindre le pic de production vers 15 j.p.i. (Peeters et al., 1992).

Les études de la réponse cellulaire à l’infection par C. parvum chez le veau ont montré que le nombre de cellules N2 (cellules non-T, non-B, population trouvée uniquement chez les ruminants) était augmentée dans la rate et dans les ganglions lymphatiques mésentériques des veaux infectés (Harp et al., 1995). Comme pour les souris SCID dans lesquelles les cellules non-T et non-B jouent un rôle important dans la résistance à l’infection, les cellules N2 du veau pourraient intervenir dans la réponse protectrice à C. parvum (Harp et al., 1995). De plus, la réponse cellulaire chez le veau infecté par C. parvum est caractérisée par une augmentation et une activation des IEL T CD8+ et par une activation des IEL T CD4+ (Pasquali et al., 1997 ; Wyatt et al., 1997). Abrahamsen et al. ont observé chez des veaux naïfs infectés par C. parvum une augmentation du nombre des lymphocytes T TCRαβ (CD4 et CD8) et TCRγδ dans la lamina propria. Chez des veaux immuns, l’inoculation du parasite induit une augmentation du nombre de lymphocytes T CD4+ dans les plaques de Peyer et une augmentation des lymphocytes T CD8+ dans l’épithélium. Ces observations sont en faveur d’un rôle des

lymphocytes T CD8+ au moins dans la résistance à la réinfection des veaux (Abrahamsen

et al., 1997). Une étude récente montre que ces cellules recrutées vers l’épithélium ne

proviennent pas de la périphérie, ce sont des lymphocytes de la muqueuse intestinale dont la distribution a été modifiée (Wyatt et al., 1999).

Chez le veau infecté, la réponse en cytokines a été mesurée localement par RT-PCR sur des cellules isolées de la lamina propria ou sur des IEL (Canals et al., 1998 ; Fayer et

al., 1998). Les IEL et LPL des veaux infectés expriment plus d’IFNγ et d’IL12 que les cellules de veaux témoins. Au contraire, les IEL de veaux infectés expriment moins de TNFα (Wyatt et al., 1997). Aucune différence dans l’expression de l’IL2, IL4 et IL10 n’a été observée chez les veaux infectés par rapport aux veaux témoins suggérant une réponse cytokine de type Th1. L’étude récente de Wyatt rapportant notamment la surexpression d’IFNγ et d’iNOS dans les lymphocytes de la lamina propria des veaux infectés confirme l’orientation Th1 de la réponse immunitaire locale à l’infection par C. parvum (Wyatt et

al., 2001).

L’utilisation des modèles murins offre de nombreux avantages pour étudier la réponse immunitaire suite à l’infection par C. parvum. La congénicité des souris permet la réalisation des expériences de transfert de cellules qui confirment les hypothèses issues des études descriptives. La manipulation et le nombre de souris disponibles sont d’autres avantages qui font que les études chez le veau sont plus difficiles à mettre en place. Les données sur la réponse immunitaire des veaux infectés sont généralement en corrélation avec celles obtenues chez les souris malgré la différence majeure dans l’organisation du système immunitaire de l’intestin entre ces deux espèces, à savoir que les plaques de Peyer chez le veau sont un organe lymphoïde primaire.

L’interféron gamma (IFNγ) est une cytokine jouant un rôle majeur dans le contrôle immunologique de la cryptosporidiose. Cependant, les mécanismes mis en jeu par cette cytokine pour protéger l’hôte contre l’infection à C. parvum sont encore peu connus. Différentes possibilités, qui ne sont pas mutuellement exclusives, incluent un effet direct de l’IFNγ sur la cellule infectée et/ou un effet indirect favorisant

(i) l’expression de molécules de surface nécessaires au bon fonctionnement du système immunitaire telles que les molécules de classe II du CMH et les molécules d’adhérence (ii) la sécrétion de composants solubles de la réponse immunitaire ayant soit un effet toxique pour le parasite soit un effet chimiotactique pour le recrutement de cellules lymphoïdes protectrices.

L’objectif de ce travail de thèse était de mettre en évidence des effecteurs de la réponse immunitaire protectrice qui sont dépendants de la production d’IFNγ. Par une technique de RT-PCR quantitative nécessitant la construction d’un certain nombre de plasmides compétiteurs, la réponse immunitaire mucosale déclenchée lors d’une infection par C. parvum a été étudiée dans deux modèles murins. Dans le premier, l’infection est résorbée spontanément, dans le second, les souris sont déficientes en IFNγ et demeurent chroniquement infectées. Ce premier modèle est un modèle conventionnel de souris nouveau-nées. Il présente l’avantage de posséder un système immunitaire initialement immature mais non altéré, permettant aux souriceaux d’éliminer le parasite spontanément en 3 semaines. De plus, nous considérons que ce modèle est plus adéquat que celui des souris immunologiquement déficientes que sont les souris SCID ou nude pour comprendre la réponse immunitaire chez le veau infecté par C. parvum.

Pour connaître l’origine et les conséquences de l’inflammation dans la cryptosporidiose, nous avons dans un premier temps étudié la réponse en cytokines pro-inflammatoires, consécutive à une infection par C. parvum à la fois in vitro, par une lignée de cellules épithéliales murines, et in vivo dans l’iléon de souriceaux. La comparaison de cette réponse à celle des souris GKO infectées nous a ensuite conduits à explorer le rôle du TNFα dans la protection vis-à-vis de C. parvum.

Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la réponse d’autres médiateurs de la réponse inflammatoire que sont les chimiokines. L’expression des chimiokines de différentes familles a été analysée dans les cellules épithéliales infectées in

vitro par C. parvum et au niveau local, dans l’iléon de souris infectées. Par la suite, nous

avons étudié le recrutement des cellules inflammatoires dans l’intestin de souris infectées pour voir si celui-ci était corrélé à la réponse en chimiokines. Ces résultats nous ont

conduits à explorer le rôle des chimiokines responsables du recrutement des lymphocytes T et dépendantes de l’IFNγ dans la protection des souriceaux par des essais de neutralisation

in vivo des chimiokines.

Enfin, toujours dans le but de mettre en évidence les composants de la réponse immunitaire dépendants de l’IFNγ présents en fin d’infection et susceptibles d’intervenir dans la protection, nous avons analysé la réponse en cytokines de type Th1/Th2 dans l’iléon des souris infectées ainsi que l’expression de iNOS à la fois in vivo et in vitro par les cellules épithéliales. La forte expression d’IFNγ produit probablement par les IEL nous a conduits à entreprendre une étude sur le rôle de ces cellules en tant que cellules productrices d’IFNγ dans la réponse protectrice à l’infection.

I- MODÈLE EXPÉRIMENTAL : LA CRYPTOSPORIDIOSE