I NITIATION DE LA RÉPONSE IMMUNITAIRE

Les animaux nouveau-nés atteints de cryptosporidiose éliminent spontanément le parasite en quelques semaines suggérant un rôle important de la réponse immunitaire dans la défense de l’hôte. Ce parasite qui infecte exclusivement les cellules épithéliales de l’intestin chez les nouveau-nés est capable d’induire une réponse immunitaire spécifique chez l’hôte infecté. Avant d’étudier la réponse immunitaire locale à l’infection par C.

parvum, il paraissait intéressant de comprendre comment était initiée cette réponse et

qu’elles étaient les cellules impliquées dans l’initiation de la réponse immunitaire.

Comme décrit précédemment dans la partie bibliographique, l’induction de la réponse immunitaire au niveau de l’intestin fait intervenir principalement les cellules M ou les cellules dendritiques. Dans le cas d’une infection par C. parvum, puisque le parasite infecte exclusivement les cellules épithéliales, les cellules dendritiques pourraient activer le système immunitaire après avoir capté des antigènes solubles libérés par le parasite. D’autre part, les cellules M étant une porte d’entrée pour de nombreux pathogènes, elles pourraient également permettre la translocation de C. parvum de la lumière intestinale vers le compartiment mucosal de l’intestin dans lequel il serait phagocyté par une cellule présentatrice d’antigène.

Jusqu’à ce jour, l’initiation de la réponse immunitaire lors d’une infection par C.

parvum a très peu été étudiée. Seul un article de Marcial et Madara (1986) montre par

microscopie électronique une vésicule présentée comme un sporozoïte de C. parvum dans un macrophage sous jacent à une cellule M, suggérant un passage du sporozoïte par la cellule M (Marcial et Madara, 1986). Dans cette étude, aucun marquage immunologique n’a été réalisé pour confirmer la présence d’un organisme de C. parvum dans un macrophage. De plus, aucun organisme de C. parvum n’a jusqu’ici été mis en évidence dans une cellule M. Dans le but de confirmer l’hypothèse et les résultats de Madara, nous avons réalisé de la microscopie électronique à transmission (MET) et de la microscopie à balayage (MEB) sur des plaques de Peyer de souris adultes GKO infectées pendant 9 jours. Ce travail, effectué parallèlement aux études décrites dans la suite de ce manuscrit, a été réalisé en collaboration avec les services communs de microscopie de l’INRA de Theix et de l’INRA de Tours.

Figure 31 : Photographies de microscopie électronique à balayage (MEB) de plaques de Peyer de souris GKO infectées par C. parvum pendant 9 jours.

A- Plaque de Peyer entourée par des villosités intestinales

B- Les différents organismes de C. parvum tapissent le FAE de la plaque de Peyer C- Au niveau du FAE, les cellules M sont facilement détectables par MEB

D- Un organisme de C. parvum a été trouvé sur quelques cellules M

Les résultats de microscopie électronique à balayage ont montré que le FAE des plaques de Peyer était très infecté 9 jours après l’inoculation des souris GKO (Figure 31). Parmi les cellules du FAE, les cellules épithéliales sont les cellules les plus infectées car seulement quelques organismes de C. parvum ont pu être retrouvés sur des cellules M. Toutefois, C. parvum n’avait jamais été mis en évidence au niveau d’une cellule M auparavant. La petite taille des organismes de C. parvum observés sur les cellules M suggère que le parasite ne se développe pas à la surface de ce type de cellule ou/et qu’il est en train de pénétrer dans la cellule M. De la microscopie électronique à transmission a ensuite été réalisée pour tenter de répondre à ces questions. Cependant, nous avons rencontré plus de difficultés à visualiser les cellules M par MET. Pour pallier ces

A B

C D

100 µm 10 µm

difficultés, deux possibilités pouvaient être envisagées : la première était d’infecter ex vivo pendant 15 minutes des plaques de Peyer avec une grande quantité de sporozoïtes de C.

parvum. Nous avons d’ores et déjà infecté ex vivo les plaques de Peyer de souris mais

l’analyse en MET est en cours. La seconde possibilité était d’utiliser le système de culture

in vitro des cellules M développé par l’équipe du Dr E. Pringault (Kerneis et al., 1997).

Le principe de cette culture de cellules M est basé sur une dé-différenciation des cellules épithéliales polarisées mises en co-culture avec des lymphocytes de plaque de Peyer de souris BALB/c comme décrit dans la partie “Matériel et méthodes”. Pour obtenir des cellules M en culture, nous avons essayé de reproduire cette technique en suivant strictement le protocole provenant du laboratoire du Dr E. Pringault. Après 20 h d’infection, la membrane de Transwell sur laquelle ont poussé les cellules épithéliales qui se sont dé-différenciées en cellules M a été observée en MET. Malgré les nombreux essais réalisés et les nombreux clichés observés, cette méthode ne nous a pas permis de mettre en évidence un organisme de C. parvum dans une cellule M. De plus, après 20 h d’infection, aucun méronte n’était observé sur les cellules épithéliales adjacentes aux cellules M. On peut se demander si le contact de 20 min des cellules épithéliales avec les sporozoïtes était suffisant pour permettre l’attachement puis le développement du parasite. Des études ont montré qu’un contact de 5 minutes est suffisant pour que le sporozoïte adhère à la cellule épithéliale (Hamer et al., 1994 ; Joe et al., 1998). Par contre, de façon étonnante, l’attachement des sporozoïtes est réduit lorsque les cellules épithéliales sont différenciées (Joe et al., 1998), ce résultat pouvant expliquer notre observation. Néanmoins, les photographies de MET montrent que nous sommes parvenus à reproduire la technique mise au point par Kerneis et al. en 1997 car quelques cellules ressemblant à des cellules M ont pu être observées (Figure 32).

Figure 32 : Culture de cellules M in vitro. Photographies de MET montrant un lymphocyte qui

traverse un pore de la membrane de Transwell (A, grossissement ×6700) et une cellule M indiquée par la flèche (B, grossissement ×5200).

A

Il semble très difficile de mettre en évidence un organisme de C. parvum dans une cellule M par MET sûrement à cause de la rareté de la pénétration et/ou de la translocation très rapide du parasite. Ceci explique aussi pourquoi peu d’études ont été publiées pour décrire l’initiation de la réponse immunitaire. Nous poursuivrons cette étude en utilisant les deux approches citées complétées par des immuno-marquages à l’or colloïdal.