La réponse au O

L’utilisation de diverses techniques de biophysique a permis de montrer que l’activité de SoxR est régulée par son état redox. Cependant la nature du signal responsable de cette modification redox est encore un sujet de controverse.

1) La présence d’un centre Fer-Soufre dans SoxR est essentielle à l’activité de SoxR

SoxR est une métalloprotéine contenant un centre [2Fe-2S] par monomère [163, 164]. La présence de ce centre est essentielle à son activité. Deux formes de SoxR peuvent être produites : la forme Fe-SoxR, contenant le centre [2Fe-2S], et la forme Apo-SoxR, dépourvue de centre métallique [163]. L’analyse de l’activité transcriptionnelle de SoxR in vitro montre que seul Fe-SoxR est capable de stimuler l’expression de SoxS [163, 164]. De plus la

mutagénèse individuelle des quatre cystéines, nécessaires à la formation du centre métallique, rend SoxR transcriptionnellement inactif [165].

2) L’activité de SoxR dépend de l’état redox du centre [2Fe-2S] La présence de métal n’est pas une condition suffisante à l’activation de SoxR. L’analyse spectroscopique et par Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) a permis de montrer que le centre Fer-Soufre de SoxR peut être soit oxydé ([Fe3+-Fe3+]) soit réduit ([Fe3+-Fe2+]) [163, 164]. La forme réduite de Fe-SoxR ne présente pas d’activité transcriptionnelle mais peut être réactivée par simple incubation à l’air [166, 167]. In vitro, l’activité transcriptionnelle de SoxR dépend du potentiel redox [167]. L’état redox du centre Fer-soufre de SoxR constitue donc un niveau de contrôle de l’activité de ce régulateur in vitro. Le couple SoxRred/SoxRox a un potentiel redox de –285 mV, une valeur proche du potentiel redox

intracellulaire mesuré.

3) Le centre Fer-soufre de SoxR est rapidement oxydé in vivo

La mise au point d’une technique de RPE, permettant la visualisation de l’état d’oxydation de SoxR in vivo [168, 169] a permis de conclure que l’activité de SoxR dépend essentiellement de l’état d’oxydation du centre [2Fe-2S]. En absence d’inducteur, 90 % de la protéine est détectée sous forme Fe-SoxR réduite. Le traitement des cellules au paraquat entraîne la disparition rapide (< 2 minutes) du signal RPE, disparition correspondant à une oxydation et non à une destabilisation du centre [2Fe-2S] de SoxR puisque le signal RPE peut être de nouveau détecté après perméabilisation et traitement des cellules avec un agent réducteur puissant, la dithionite. L’élimination du paraquat par lavage des cellules permet également de restaurer ce signal, indiquant que le centre Fer-Soufre de SoxR est rapidement réduit après élimination de l’inducteur [168, 169]. La stimulation de l’expression de SoxS est corrélée in

vivo avec l’oxydation de SoxR [168]. Le centre Fer-Soufre de SoxR est donc oxydé in vivo et

Figure 10. Modèle d’activation du régulon SoxRS. Le signal induit par le stress superoxyde est détecté

par SoxR, qui forme alors un complexe ouvert avec l’ARN Polymérase et initie la transcription de SoxS. L’augmentation de la concentration en SoxS permet l’induction des gènes du régulon.

Figure 11. Activation de SoxR par oxydation de son centre Fer-Soufre. Représentation des différents

signaux susceptibles d’oxyder SoxR. La présence d’ions superoxyde ou l’augmentation du rapport NADP+

/NADPH sont vraisemblablement deux signaux de nature différente capables d’activer SoxR. L’oxydation du NADPH en NADP+

par les composés à activité redox cyclique pourrait limiter la capacité d’une réductase spécifique à réduire SoxR et donc conduire à son activation.

Un autre modèle d’activation de SoxR par assemblage-désassemblage du centre Fer-Soufre a également été proposé [170, 171]. Cependant, les données in vivo obtenues par RPE suggèrent que ce mode d’activation n’est pas prépondérant.

4) Comment la forme oxydée de SoxR active-t-elle la transcription de soxS ?

La présence du centre Fer-Soufre de SoxR ne contrôle ni sa liaison au promoteur de soxS, ni le recrutement de l’ARN polymérase [163]. Comment l’état d’oxydation du centre Fer-Soufre régule-t-il la transcription de soxS ? La liaison de SoxR au promoteur de soxS présente des caractéristiques inhabituelles. Les boîtes –10 et –35 du promoteur de soxS sont anormalement espacées et SoxR se lie entre ces deux séquences, un site généralement lié par les répresseurs. L’activation de SoxR provoquerait un remodelage structural des régions –10 et –35 du promoteur, permettant alors l’induction de SoxS [172].

Ainsi, la liaison, au promoteur de SoxS, de Fe-SoxR (oxydé au cours de la purification) et de l’ARN polymérase promeut la formation d’un complexe de transcription ouvert, indétectable en présence d’Apo-SoxR [164] (Fig. 10). L’oxydation du centre Fer-Soufre de SoxR serait donc indispensable à l’initiation de la transcription.

5) Quel est le signal détecté par SoxR ? (Fig. 11)

SoxR est activé par l’exposition des cellules à des composés à activité redox cyclique. Ces molécules sont réduites par le biais de réductases NADPH-dépendantes et leur ré-oxydation se fait par réduction de l’oxygène moléculaire. Leur cycle d’oxydo-réduction entraîne donc simultanément une production importante d’ions superoxyde et une oxydation du pool de NADPH. SoxR est-il activé par la production d’ions superoxyde ? La réactivité spécifique de l’ion superoxyde avec les centres Fer-Soufre, rend cette hypothèse attractive. Afin de tester ce mécanisme, la concentration intracellulaire en ion superoxyde a été artificiellement modulée soit par la surexpression soit par l’invalidation des superoxyde-dismutases et l’effet sur l’état d’activation de SoxR a été analysé. L’activité basale de SoxR est augmentée dans des mutants dépourvus de superoxyde-dismutase [104, 173] et cette activation est dépendante de la

présence d’oxygène [110]. L’absence de SOD accroit également l’intensité de la réponse transcriptionnelle après induction par le paraquat [110]. Ces résultats suggèrent que O2

.-

est effectivement un inducteur de SoxR.

O2

.-

ne semble cependant pas être le seul signal détecté par SoxR. En effet, la surexpression de l’activité SOD ne diminue pas l’induction du régulon SoxR par le paraquat. [105, 174], suggérant que dans ce cas, l’activation de SoxR est indépendante de la concentration en ion superoxyde. SoxR est-il activé en réponse à l’oxydation du NADPH? La déplétion artificielle du NADPH dans un mutant de la G6PDH (zwf), permet une stimulation accrue des gènes SoxRS-dépendants en réponse au paraquat [105], conduisant les auteurs à postuler que l’augmentation du rapport NADP+

/NADPH agit comme un signal d’activation pour SoxR. Ce rapport pourrait en particulier influer sur la capacité de SoxR à être réduit par une réductase spécifique.

6) Quelle réductase pour SoxR ?

Le potentiel redox du couple SoxRred/SoxRox étant proche du potentiel redox intracellulaire, le

maintien d’une forme majoritairement réduite, observée en RPE in vivo, impliquerait la réduction permanente de SoxR par une réductase spécifique. L’inhibition de cette réductase pourrait donc permettre l’oxydation et l’activation de SoxR. Le rôle de différentes réductases dans la réduction de SoxR a été testé, sans succès. L’effet de l’invalidation ou de la surexpression d’une ferredoxine oxidoreductase NADPH dépendante (fpr), identifiée comme une cible de SoxRS [106] a tout d’abord été analysé. En effet, cette enzyme aurait pu être le lien manquant entre l’état redox de SoxR et celui du pool de pyridine nucléotide. Cependant, la fpr est incapable de réduire SoxR in vitro en présence de NADPH [166], et la surexpression de cette enzyme entraîne une stimulation de l’activité de SoxR plutôt qu’une atténuation [175]. La surexpression de la fpr entraînant une oxydation accrue du NADPH, cette observation renforce l’idée que le rapport NADP+

/NADPH est important dans le contrôle de l’activité de SoxR. Les tentatives d’identification de la réductase de SoxR ont été jusque-là infructueuses. Cet échec peut s’expliquer si plusieurs voies de réduction de SoxR existent ou si cette réductase est essentielle à la viabilité cellulaire. Une équipe a cependant isolé une

activité capable de réduire SoxR in vitro en présence de NADPH [176]. Malheureusement, l’identité de cette activité reste encore inconnue.