II.1. Introduction
Dans le but d’étudier la régulation de l’expression de gènes d’intérêt, plusieurs approches peuvent être envisagées. Au-delà de l’approche RT-PCR en temps réel abordée dans le premier chapitre, une autre approche, permettant d’obtenir des informations concernant la régulation de l’expression de ces gènes, consiste à étudier leur régulation via l’étude de la régulation de leur promoteur.
En effet, par le biais de l’étude des promoteurs, il est possible de disposer à la fois d’informations quant à la régulation du gène, à son expression organo- et tissu-spécifique et ce type d’information est le reflet réel d’une augmentation de transcription du gène étudié. Dans la première étude de ce manuscrit, nous avons focalisé notre travail sur les organes, racines, tiges, limbes et pétioles.
Une étude des promoteurs permettra d’une part d’obtenir des informations plus précises sur la régulation tissu-spécifique de nos gènes d’intérêt. D’autre part, l’accès à ces régions permettra d’identifier les zones cis-régulatrices permettant la régulation des gènes et d’avoir une vision plus globale des facteurs environnementaux pouvant les réguler.
II.2. Contexte d’étude et objectifs
Dans le chapitre précédent, nous avons montré l’expression constitutive du gène RR13 ainsi que l’augmentation des teneurs en transcrits après application d’une contrainte osmotique aux temps courts d’application dans les racines ainsi que dans les feuilles, mais de manière plus tardive.
En ce qui concerne le RR18, nous avons également pu voir une augmentation des teneurs en transcrits après des temps longs d’exposition au stress dans les feuilles.
Concernant le RR19 une étude préalable avait permis d’établir la présence des transcrits de ce RR dans l’ensemble des organes de la plante en condition témoin et après l’application d’une
contrainte osmotique (Bertheau et al., 2012) et cette donnée a pu être complétée au cours de notre
étude (chapitre précédent) par une expression de ce RR dans des feuilles soumises à un stress long (deux heures).
Le RR22, dont l’expression n’a pas été observée dans l’étude précédente a, au contraire pu être localisé dans des feuilles soumises à 10 et 120 minutes de contrainte osmotique. Cependant, la localisation de l’expression de ce RR-B dans les autres organes n’a jusqu’à présent pas pu être étudiée.
Pour le gène HK1a, des études préalables ont pu montrer :
o Une expression constitutive du gène HK1a montrant de plus fortes teneurs de transcrits
dans les parties aériennes que dans les parties souterraines (Thèse L. Bertheau, 2013).
o Une augmentation des teneurs en transcrits codant HK1a dans les racines après 10
minutes de traitement au PEG6000 à 50 g/L de (Chefdor et al., 2006)
o Ces résultats ont été corroborés par une étude par RT-PCR en temps réel de l’expression de
HK1a dans différents organes en condition témoin (Figure 14) et selon une cinétique de
Figure 14 : analyse part RT-PCR quantitative de l’expression de HK1a dans différents organes de peuplier après croissance en hydroponie en condition témoin et soumises à une cinétique de stress au PEG6000 à 100 g/L.
Un microgramme d’ARN totaux a été utilisé pour réaliser la synthèse des ADNc. L’expression de HK1a a été mesurée dans les racines (A), les tiges (B), les pétioles (C) et les feuilles (D). La valeur moyenne et l’erreur standard ont été calculées pour chaque temps et chaque organe et la normalisation des résultats a été effectuée par rapport au temps 0 de l’organe considéré. Un test t a permis d’établir la significativité des différences observées. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. Extrait de la thèse de L. Bertheau, 2013.
Il a ainsi été montré :
o qu’une augmentation des teneurs en transcrits d’un facteur 20 est observée au niveau des
racines dès 5 minutes de contrainte osmotique et que le niveau des transcrits de ce gène était maintenu supérieur à ceux observés dans la condition contrôle durant l’ensemble des 6 heures de contrainte osmotique.
o qu’une augmentation rapide des transcrits respectivement d’un facteur 2 et 3 se produit
dans les feuilles et les tiges après 10 minutes de contrainte (Figure 14, B et D). Cette expression diminue ensuite progressivement dans les feuilles et reste relativement stable au niveau des tiges.
o Qu’aucune régulation n’a pu être observée dans les pétioles (Figure 14, C) au cours des 6
heures de cinétique.
Une étude récente au sein du laboratoire a pu mettre en évidence que le gène HK1a était tout comme les gènes codant les RR-B, un gène dupliqué. Le premier gène étudié a donc été nommé HK1a et le second gène a été nommé HK1b. La fonction d’histidine aspartate kinase de ce second gène a pu être observée et une meilleure performance en tant qu’osmosenseur en levure a été démontrée pour
ce second récepteur (Héricourt et al., 2016, soumis).
Ainsi, nos objectifs étaient d’une part de disposer d’informations concernant les zones cis-régulatrices de ces promoteurs afin de pouvoir disposer d’une vision globale des facteurs affectant la régulation de ces gènes et d’autre part de compléter nos données concernant la régulation organo et
tissu-spécifique de l’expression des gènes codant les RR13, 18, 19 et 22 et les gènes codant les récepteurs HK1a et 1b.
Pour ce faire, nous avons opté pour l’isolement des promoteurs de ces gènes et via agrotransformation du clone 717-1B4 du génotype Populus tremula x P. alba, étudier la localisation et la régulation de l’expression de ces gènes in planta.
Afin de réaliser nos objectifs, nous avons dû tout d’abord récupérer et analyser les séquences correspondant à l’ensemble de ces partenaires dans le clone 717-1B4.
Nous avons ensuite cloné ces promoteurs en amont du gène rapporteur GUS puis transformé des plants de peuplier par ces différentes constructions.
Nous avons finalement étudié la régulation du promoteur HK1a et la localisation de son expression via l’observation de l’activité du gène rapporteur GUS, en condition physiologique, sous stimulus CK et
enfin par application d’une contrainte osmotique au PEG6000.
II.3. Résultats
II.3.a - Isolement et analyse bio-informatique des promoteurs de HK1a HK1b,
RR13, RR18, RR19 et RR22 du clone 717-1B4.
Afin de récupérer les séquences promotrices des différents partenaires étudiés pour le clone 717-1B4, nous avons recherché les séquences correspondantes dans la banque de données Phytozome chez le génotype P. trichocarpa.
Des amorces permettant une amplification d’une taille théorique avoisinant les 3 kb ont été choisies pour chaque gène.
Cette approche a pu être réalisée avec succès pour la récupération des séquences promotrices des gènes HK1a et RR13. Cependant, pour les autres partenaires, une approche différente a été élaborée en conséquence d’une absence d’amplification.
Pour ces 4 partenaires (HK1b, RR18, 19 et 22), des amorces 5’ balayant la zone de 3 kb d’intérêt ont été choisies sur le génotype P. trichocarpa et des amorces 3’ connues pour permettre une amplification de ces gènes ont été utilisées.
Nous avons ainsi pu obtenir la zone complète de 3 kb pour les promoteurs de HK1a et RR13, et des portions encore incomplètes pour les autres zones promotrices. Pour les autres gènes, les analyses bio-informatiques ont été effectuées sur les séquences isolées et les portions manquantes ont été analysées à partir de données in silico.
II.4.a - i -Etude du promoteur de HK1a
Pour ce gène, la séquence recherchée sur le génotype P. trichocarpa était de 2971 pb et les amorces choisies ont permis d’amplifier une séquence correspondante pour le clone 717-1B4 de 2943 pb à partir du codon d’initiation de la traduction (Figure 15a).
Nous avons sélectionné une zone promotrice de 2882 pb placée en amont du gène rapporteur GUS (promHK1a-GUS) présentée en figure 15 ci-dessous.
Figure 15 : analyse des motifs cis-régulateurs présents au sein de la séquence promotrice de HK1a et permettant potentiellement la fixation des RR-B.
Fig. 15a : séquence nucléique. Le codon permettant l’initiation de la traduction est représenté en bleu ciel, le 5’ non traduit en souligné, les boites TATA et CAAT putatives sens sont respectivement surlignées en rouge ou représentées en encadré et avec une écriture de couleur rouge. Les boites 5-NGATT-3’ et 5-NGATV-3’ sens sont représentées en surlignées en violet ou en écriture violette, et l’ensemble de ces boites en position antisens est représentée en surlignée en gris. Les amorces permettant la construction prom-HK1a sont représentées en surligné jaune.
Fig. 15b : schéma de la présence des motifs putatifs cis-régulateurs dans leur totalité permettant la fixation des RR-B.
Lors de l’analyse du promoteur de HK1a, de nombreux sites de fixation ont pu être identifiés soit un total de 41 motifs dont des sites de fixation des RR-B caractérisés par les séquences 5’-NGATT-3, 5’-NGATV-3’ ou des motifs étendus de fixation de l’ARR1 (RR-B d’Arabidopsis thaliana) dont la séquence a été bien caractérisée (Figure 15 a et b).
Puisque la fixation des facteurs de transcription agissant sous forme dimérique nécessite la présence coordonnée de deux séquences de fixation en orientation sens et antisens, nous avons procédé à une sélection parmi les motifs putatifs identifiés précédemment, et nous en avons retenu 9 potentiellement actifs (Figure 15 c).
L’analyse bio-informatique a également révélé l’existence de 5 sites putatifs de fixation de facteurs de transcription de type MYB (ou Myb-Binding Site MBS), ainsi qu’un site putatif de réponse aux auxines, 4 sites putatifs de réponse au méthyljasmonate et un site potentiellement impliqué dans
une réponse au stress thermique (Figure S16 ANNEXE 7).
II.4.a - ii - Etude du promoteur de HK1b
Pour ce gène, nous avons isolé une séquence d’une longueur de 714 pb sur la longueur de 2916 pb théorique à cloner chez Populus tremula x P. alba. La partie manquante recherchée a été complétée par la séquence in silico (Figure 16).
Figure 16 : analyse des motifs cis-régulateurs présents au sein de la séquence promotrice de HK1b et permettant potentiellement la fixation des RR-B.
Fig. 16a1 et a2 : séquence nucléique. La séquence du haut (a1) correspond à la séquence du génotype P. trichocarpa et celle du bas (a2) au génotype Populus tremula x P. alba. Le codon permettant l’initiation de la traduction est représenté en bleu ciel, le 5’ non traduit en souligné, les boites TATA et CAAT putatives sont respectivement surlignées en rouge ou représentées en encadré et écrites en rouge. Les boites 5-NGATT-3’ et 5-NGATV-3’ sens sont représentées en surligné violet ou en écriture violette, et l’ensemble de ces boites en position antisens est représentée en surligné gris ou en écriture grise dans le cas de la boite située dans l’amorce 3’. Les amorces permettant la construction prom-HK1b sont représentées en surligné jaune et l’amorce ayant permis la récupération de la séquence du génotype Populus tremula x P. alba est représentée en vert foncée.
Fig 16b : schéma de la présence des motifs putatif cis-régulateurs dans leur totalité permettant la fixation des RR-B. Fig 16c : Schéma de la présence des motifs putatif cis-régulateurs d’intérêt permettant la fixation des RR-B.
Fig. 16b et c : la partie en pointillée correspond à la séquence théorique retrouvée dans les banques de données pour le génotype P. trichocarpa et la séquence en trait plein correspond à la séquence expérimentalement obtenue pour le clone 717-1B4 du génotype Populus tremula x P. alba.
Lors de l’analyse du promoteur de HK1b, un total de 37 motifs 5’-NGATT-3 et 5-NGATV-3’ a pu être mis en évidence en orientation sens et antisens (Figure 16 a1, a2 et b). A l’inverse de HK1a, aucun motif étendu de fixation de l’ARR1 n’a été retrouvé au sein de cette séquence.
Comme précédemment, nous avons procédé à une sélection parmi les motifs putatifs identifiés précédemment (Figure 16 c), et nous en avons retenu 6 potentiellement actifs.
L’analyse bio-informatique a également révélé l’existence de 3 sites putatifs de fixation de facteurs de transcription de type MYB (MBS), ainsi qu’un site putatif de réponse aux auxines, et 2 sites potentiellement liés à la réponse au stress thermique. De manière intéressante, 2 sites putatifs de réponse à l’ABA, 2 sites putatifs de réponse à l’acide salicylique, 1 boite putative de réponse aux gibbérellines, un site putatif de réponse à l’éthylène et 1 site putatif de réponse aux basses températures sont présents dans la séquence de HK1b et tous absents de la séquence de HK1a,
suggérant une divergence de fonctions de ces deux gènes paralogues (Figure S17 ANNEXE 7).
II.4.a - iii -Etude du promoteur du RR13
Pour ce gène, la séquence recherchée sur le génotype P. trichocarpa était de 2970 pb et les amorces choisies ont permis d’amplifier une séquence correspondante pour le génotype Populus tremula x P. alba de 2778 pb (Figure 17a).
Pour la suite de notre étude, nous avons sélectionné une zone de 2730 pb, placée en amont du gène rapporteur GUS (promRR13-GUS) et représentée en figure 17.
Figure 17 : analyse des motifs cis-régulateurs présents au sein de la séquence promotrice de RR13 et permettant potentiellement la fixation des RR-B.
Fig. 17a : séquence nucléique. Le codon permettant l’initiation de la traduction est représenté en bleu ciel, le 5’ non traduit en souligné, les boites TATA et CAAT putatives sont respectivement surlignées en rouge ou représentées en encadré et écrites en rouge. Les boites 5-NGATT-3’ et 5-NGATV-3’ sens sont représentées en surligné violet ou en écriture violette, et l’ensemble de ces boites en position antisens est représenté en surligné gris. Les amorces permettant la construction prom-RR13 sont représentées en surligné jaune.
Fig 17b : schéma de la présence des motifs putatif cis-régulateurs dans leur totalité permettant la fixation des RR-B. Fig 17c : schéma de la présence des motifs putatif cis-régulateurs d’intérêt permettant la fixation des RR-B.
L’analyse du promoteur du RR13 a permis d’isoler un total de 48 motifs 5’-NGATT-3, et 5-NGATV-3’ (Figure 17 a et b). A l’instar de HK1b et à l’inverse de HK1a, aucun motif étendu de fixation de l’ARR1 n’a été retrouvé au sein de cette séquence.
Comme précédemment, nous avons procédé à une sélection parmi les motifs putatifs identifiés précédemment (Figure 17 c), et nous avons retenu 8 sites potentiellement actifs.
L’analyse bio-informatique a également révélé l’existence de 4 sites putatifs de fixation de facteurs de transcription de type MYB (MBS), ainsi que 4 sites putatifs de réponse à l’ABA, 1 site
putatif de réponse à l’acide salicylique et 2 boites putatives de réponse aux gibbérellines (Figure S18
ANNEXE 7).
II.4.a - iv -Etude du promoteur du RR18
Pour ce gène, une séquence d’une longueur de 2377 pb à partir du codon d’initiation de la traduction a été récupérée à ce jour, permettant d’obtenir un fragment de 2248 pb. L’analyse de ce promoteur est présentée dans la figure 18 ci-dessous.
Figure 18 : analyse des motifs cis-régulateurs présents au sein de la séquence promotrice du RR18 et permettant potentiellement la fixation des RR-B.
Fig. 18a1 et a2 : Séquence nucléique. La séquence du haut (a1) correspond à la séquence du génotype P. trichocarpa et celle du bas (a2) au génotype Populus tremula x P. alba. La séquence du haut correspond à la séquence du génotype P. trichocarpa et celle du bas au génotype Populus tremula x P. alba. Le codon permettant l’initiation de la traduction est représenté en bleu ciel, le 5’ non traduit en souligné, la boite TATA putative est surlignée en rouge et la boite CAAT putative sens est représentée en encadré rouge. Les boites 5-NGATT-3’ et 5-NGATV-3’ sens sont représentées en surligné violet ou en écriture violette, et l’ensemble de ces boites en position antisens est représenté en surligné gris ou en écriture grise dans le cas de la boite située dans l’amorce 3’. Les amorces permettant la construction prom-RR18 sont représentées en surligné jaune et l’amorce ayant permis la récupération de la séquence du génotype Populus tremula x P. alba est représentée en vert kaki.
Fig 18b : Schéma de la présence des motifs putatif cis-régulateurs dans leur totalité permettant la fixation des RR-B. Fig 18c : Schéma de la présence des motifs putatif cis-régulateurs d’intérêt permettant la fixation des RR-B.
Fig. 18b et c : La partie en pointillé correspond à la séquence théorique retrouvée dans les banques de données pour le génotype P. trichocarpa et la séquence en trait plein correspond à la séquence expérimentalement obtenue pour le clone 717-1B4 du génotype Populus tremula x P. alba.
L’analyse du promoteur du RR18 a permis d’isoler un total de 48 motifs 5’-NGATT-3, et 5-NGATV-3’ (Figure 18 a et b). A l’instar de HK1b et à l’inverse de HK1a, aucun motif étendu de fixation de l’ARR1 n’a été retrouvé au sein de cette séquence.
La sélection parmi les motifs putatifs identifiés précédemment (Figure 18 c) nous permet d’en retenir 8 potentiellement actifs.
L’analyse bio-informatique a également révélé l’existence de 2 sites putatifs de fixation de facteurs de transcription de type MYB (MBS), ainsi que 4 sites putatifs de réponse à l’ABA, 5 sites putatifs de réponse à l’acide salicylique, 1 élément putatif de réponse aux auxines, 2 éléments de réponse au methyljasmonate, 4 boites putatives de réponse aux gibbérellines ainsi que 2 éléments
putatifs de réponse au stress thermique (Figure S19 ANNEXE 7).
II.4.a - v - Etude du promoteur du RR19
Nous avons isolé pour ce promoteur une séquence d’une longueur de 759 pb. L’analyse de la zone isolée est présentée dans la figure 19 a. Cette zone a été complétée afin d’obtenir un promoteur de taille comparable aux promoteurs précédents en récupérant la portion manquante dans la banque de donnée Phytozome. Ce promoteur reconstitué est présenté dans la figure 19 ci-dessous.
Figure 19 : analyse des motifs cis-régulateurs présents au sein de la séquence promotrice du RR19 et permettant potentiellement la fixation des RR-B.
Fig. 19a1 et a2 : Séquence nucléique. La séquence du haut (a1) correspond à la séquence du génotype P. trichocarpa et celle du bas (a2) au génotype Populus tremula x P. alba. La séquence du haut correspond à la séquence du génotype P. trichocarpa et celle du bas au génotype Populus tremula x P. alba. Le codon permettant l’initiation de la traduction est représenté en bleu ciel, le 5’ non traduit en souligné, les boites TATA et CAAT putatives sont respectivement surlignées en rouge ou représentées en encadré et écrite en rouge. Les boites NGATT-3’ et 5-NGATV-3’ sens sont représentées en surligné violet ou en écriture violette, et l’ensemble de ces boites en position antisens est représenté en surligné gris ou en écriture grise dans le cas de la boite située dans l’amorce 3’. Les amorces permettant la construction prom-RR19 sont représentées en surligné jaune et l’amorce ayant permis la récupération de la séquence du génotype Populus tremula x P. alba est représentée en bleu/vert.
Fig 19b : Schéma de la présence des motifs putatif cis-régulateurs dans leur totalité permettant la fixation des RR-B. Fig 19c : Schéma de la présence des motifs putatif cis-régulateurs d’intérêt permettant la fixation des RR-B.
Fig. 19b et c : La partie en pointillée correspond à la séquence théorique retrouvée dans les banques de données pour le génotype P. trichocarpa et la séquence en trait plein correspond à la séquence expérimentalement obtenue pour le clone 717-1B4 du génotype Populus tremula x P. alba.
L’analyse du promoteur du RR19 (isolé et in silico) a permis d’isoler un total de 56 motifs 5’-NGATT-3, et 5-NGATV-3’ (Figure 19 a et b), et aucun motif étendu de fixation de l’ARR1 n’a été retrouvé au sein de cette séquence.
La sélection parmi les motifs putatifs identifiés précédemment (Figure 19 c) nous permet de retenir 10 sites potentiellement actifs.
L’analyse bio-informatique permettant d’établir la présence d’éléments cis-régulateurs annexes sera très prochainement effectuée.
II.4.a - vi -Etude du promoteur du RR22
Nous avons isolé une séquence d’une longueur de 1022 pb. L’analyse de la zone isolée de 1022 pb est présentée dans la figure 20 a. Cette zone a été complétée afin d’obtenir un promoteur de taille comparable aux promoteurs précédents en récupérant la portion manquante dans la banque de donnée Phytozome. Ce promoteur reconstitué est présenté dans la figure 20 ci-dessous.
Figure 20 : analyse des motifs cis-régulateurs présents au sein de la séquence promotrice du RR22 et permettant potentiellement la fixation des RR-B.
Fig. 20a1 et a2 : Séquence nucléique. La séquence du haut (a1) correspond à la séquence du génotype P. trichocarpa et celle du bas (a2) au génotype Populus tremula x P. alba. La séquence du haut correspond à la séquence du génotype P. trichocarpa et celle du bas au génotype Populus tremula x P. alba. Le codon permettant l’initiation de la