II.1. Extraction des acides nucléiques
II.1.a - Extraction des ARN totaux
Cette étape a été réalisé dans le cas de l’analyse des niveaux d’extinction de transcrits des lignées RNAi de peuplier 717-1B4 pour les RR18, 19 et 22. Le kit NucleoSpin RNA Plant (Magerey-Nagel) a été utilisé en suivant les instructions du fournisseur et à partir de 100 mg de matériel végétal broyé provenant de cals témoins de transformation. L’étape de lyse initiale a été réalisée par mélange de poudres obtenues après broyage avec le tampon RAP fourni auquel 3,5 µL de β-mercaptoéthanol ont été ajoutés. L’étape d’élution des ARN a été réalisée par ajout de 40 µL d’eau dépourvu de RNases.
II.1.b - Extraction d’ADN plasmidique
Ces extractions sont réalisées à partir de cultures de bactéries E.coli préalablement transformées par les plasmides d’intérêt et mises en culture sur une nuit à 37°C sous agitation de 250 RPM. Les cultures sont ensuite transférées dans un microtube de 2 mL puis centrifugées à température ambiante pendant 2 minutes à 13000 RPM. Le culot est resuspendu au vortex dans 200 µL de solution I (25 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, 0,1 mg/mL RNase). La lyse alcaline des cellules est réalisée par ajout de 200 µL de solution II (0,2 mM NaOH, 1% Sodium Dodécylsufate (SDS)) et homogénéisation des tubes, puis 200 µL de solution III (11,5% acide acétique, 3 M acétate de potassium) sont rajoutés afin de dissocier les ADN plasmidiques et génomiques puis les tubes sont réhomogénéisés par retournement. Les débris cellulaires sont ensuite précipités par centrifugation pendant 10 minutes à 4°C à 13000 RPM et les surnageants contenant l’ADN plasmidique sont récupérés dans de nouveaux microtubes de 1,5 mL. Après précipitation de l’ADN plasmidique par ajout de 500 µL d’isopropanol et centrifugation pendant 15 minutes à 4°C et 13000 RPM, les culots obtenus sont finalement lavés par ajout de 500 µL d’éthanol à 70% (v/v), séchés à l’aide du miVac DNA concentrator (Genevac) puis par incubation à 37°C pendant 5 minutes. La resuspension des ADN est réalisée à température ambiante par ajout de 50 µL d’eau ultrapure.
II.1.c - Extraction d’ADN génomique de peuplier
L’extraction d’ADN génomique (ADNg) de peuplier a été réalisée sur le génotype 717-1B4 afin de permettre la récupération des séquences promotrices de différents partenaires de la voie de signalisation étudiée au laboratoire.
Un gramme de matière fraiche est broyé dans l’azote liquide et la poudre obtenue est mélangée avec 6 mL de tampon d’extraction (1,4M NaCl, 20 mM EDTA pH8, 100 mM Tris pH8 et 2% Bromure d’hexadéCylTrimethylAmmonium (CTAB)) préalablement chauffé à 60°C. Les tubes sont homogénéisés par inversion puis 50 µL de β-mercaptoéthanol ont été ajoutés. Le mélange est incubé pendant 30 minutes à 60°C sous agitation douce et constante.
Du chloroforme est ajouté à raison de 6 mL par tube puis les tubes sont homogénéisés par inversion douce pendant 5 minutes. Après une centrifugation de 10 minutes à 5500 RPM, la phase aqueuse est récupérée.
Un volume d’isopropanol égal au volume de la phase aqueuse est ajouté et l’ensemble est mélangé par inversion douce. L’ADN précipité est récupéré par usage d’une baguette en verre ou d’un cône en plastique et est resuspendu dans un volume d’éthanol à 70% dépendant de la quantité estimée d’ADN (de 500 µL à 1,5 mL).
Les tubes sont incubés à température ambiante 15 minutes puis centrifugés pendant 5 minutes à 8000 RPM. Le culot est séché au MiVac puis par incubation à 37°C pendant 5 minutes puis resuspendu dans 500 µL de tampon 10 mM Tris pH8, 1mM EDTA (TE) après des étapes de chauffage successives à 50°C permettant d’améliorer la resolubilisation du culot. L’ADNg obtenu est aliquoté et conservé à -20°C.
II.2. Purification d’ADN
II.2.a - Purification d’ADN en solution ou à partir d’un gel d’agarose
Lors d’un clonage moléculaire, les partenaires à cloner précédemment préparés doivent être récupérés. Ces partenaires peuvent inclure des produits PCR ou bien des résultats de digestions enzymatiques. Ces types d’ADN peuvent provenir de sources différentes.
En effet, les ADN peuvent être préalablement analysés à l’aide d’une électrophorèse en gel d’agarose afin de déterminer la présence éventuelle d’amplifications aspécifiques dans le cas de l’ADN obtenu par amplification PCR ou bien discriminer le fragment d’ADN digéré vis-à-vis d’ADN non digéré ou non désiré pour la suite du clonage (vecteur vide ou reliquat de site multiple de clonage par
exemple) dans le cas de l’ADN obtenu par digestion enzymatique. Les ADN peuvent également être purifiés directement dans le tampon réactionnel de la PCR lorsque la réaction PCR est caractérisée comme ne produisant qu’un produit unique ou bien dans le tampon de digestion lorsqu’une digestion enzymatique séquentielle est réalisée par exemple.
Les produits d’ADN issus d’amplification ou de digestion enzymatique sont purifiées soit directement soit après excision de la bande d’intérêt visualisée sur un gel d’agarose à l’aide du kit NucleoSpin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel) en suivant les instructions du fournisseur. Les étapes optionnelles sont incluses. Ainsi, l’élution est réalisée par ajout de 40 µL de tampon NE préalablement chauffé à 70°C et appliqué en deux volumes de 20 µL sur la colonne et par deux séries de centrifugation, la première à 100 g et la deuxième à 11000 g.
II.2.b - Purifications de PCR de séquençage
Les amplicons obtenus par PCR de séquençage évoquée dans le paragraphe Méthodes, chapitre I.3 de ce manuscrit sont précipités par ajout de 80 µL d’éthanol à 80% et centrifugation à 13000 RPM pendant 15 minutes à 4°C. Les surnageants sont éliminés et les culots lavés par ajout de 150 µL d’éthanol à 70% puis les tubes sont centrifugés à 13000 RPM pendant 5 minutes à 4°C. Les ADN sont finalement repris dans 25 µL d’eau ultrapure.
La lecture des séquences d’ADN réalisées s’effectue à l’INRA d’Ardon, par le biais du
séquenceur ABI 3500 Genetic Analyzer et l’analyse est effectuée à l’aide du logiciel BioEdit® (Hall,
1999).
II.3. Analyse des acides nucléiques
II.3.a - Electrophorèse en gel d’agarose
Cette étape a pris part au sein de nombreuses expérimentations, puisqu’elle nous a permis d’apprécier la pureté des ADN et l’intégrité des ARN extraitsou bien de visualiser la présence de produits PCR ou d’ADN digéré ou bien encore d’estimer visuellement la taille ou la quantité d’un ADN produit par PCR.
L’électrophorèse s’effectue après dépôt des échantillons soit directement après la PCR lors de
l’utilisation de la Gotaq® et de son tampon coloré comprenant un agent de charge associé à deux
sondes colorées soit par ajout d’un tampon de charge 6X à concentration finale 1X (30% glycérol ; 0,25% de bleu de bromophénol) et le marqueur de taille utilisé est le SmartLadder MW-1700-10 (Eurogentec). Le pourcentage des gels utilisés varie de 0,8 % à 1,2 % (m/v) selon le pouvoir discriminant souhaité et la migration s’effectue dans du tampon TAE 1X (40 mM Tris-Acétate, 1 mM EDTA) à 100 ou 50V, de voltage dépendant de la volonté de récupérer le fragment d’ADN ou pas. La révélation des acides nucléiques s’effectue sous lumière à émission d’Ultraviolets (UV) après incubation du gel pendant 15 minutes dans une solution de Bromure d’Ethidum (BET) à 0,1 µg/mL.
II.3.b - Digestions enzymatiques
A l’exception de la réaction de dégradation des ADN par action d’une DNase I, réalisée dans les expériences de rétrotranscription des ARN en ADNc et provenant du fournisseur Thermofisher Scientifics (DNase I et TurboDNase), l’ensemble des digestions enzymatiques ont été effectuées avec des enzymes de restrictions provenant de New England Biolabs (NEB). Ces dernières ont permis soit de libérer un insert ou linéariser un vecteur en vue d’un clonage moléculaire, soit de vérifier l’orientation d’un clonage par digestion orientée.
La réaction de dégradation des ADN par action d’une DNase I est développée dans la partie I.4.a de ce manuscrit). Les réactions enzymatiques mettant en jeu les enzymes NEB sont réalisées à partir de 500 ng à 6 µg d’ADN plasmidique mis en contact avec 5 à 10 U d’enzymes et du tampon réactionnel 1X adéquat fourni avec l’enzyme à concentration 10X. Les digestions sont effectuées à 37°C
pendant une durée variant de 3 heures à une nuit dans un volume final de 20 à 50 µL et les Les produits de digestion sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose.
II.3.c - Dosage des acides nucléiques
La concentration des acides nucléiques a été déterminée par dosage spectrophotométrique à
l’aide du NanoDrop® ND 1000 (Thermo Scientific). Cet appareil permet d’une part de déterminer
l’absorbance des échantillons à 260 nm (A260), zone d’absorbance des acides nucléiques, mais
également à 280 nm (A280), correspondant à la zone d’absorption des protéines et à 230 nm (A230),
zone d’absorption de différentes molécules chimiques pouvant être contenues dans les kits utilisés. Le
logiciel associé à l’appareil permet le calcul des rapports A260/A280 et A260/A230 permettant d’évaluer la
pureté des échantillons.