Nous avons décrit la synthèse de dix-sept 1,2,4-triazoles 1,3,5-trisubstitués avec un groupement 3-pyridol en position 5. Toutes ces molécules ont été caractérisées en fluorescence dans 4 solvants différents : l’acétonitrile, l’éthanol, le dichlorométhane et l’eau. Les mesures d’absorption et d’excitation ont montré des variations sur les maxima inférieures à 5 nm entre les différents solvants. D’autre part, grâce aux spectres d’excitation du triazole T16 nous avons pu mettre en évidence la présence de deux formes distinctes lors des mesures de fluorescence dans le dichlorométhane. Ces deux formes tautomères sont les formes énol et céto intervenant dans un mécanisme de fluorescence de type ESIPT (figure 2.43).
Les spectres de fluorescence des triazoles dans l’acétonitrile et l’éthanol sont très similaires sur la forme, seul diffère l’intensité de la fluorescence. L’acétonitrile a été notre solvant de référence durant toutes les analyses complémentaires : coefficient d’extinction molaire et rendement quantique. Les valeurs des paramètres optiques des triazoles d’intérêt sont résumées dans le tableau ci-dessous.
y = 4215,9x - 3023,5 R² = 0,9901 19000 20000 21000 22000 23000 24000 25000 26000 27000 5,400 5,900 6,400 6,900 1/ λe m ( cm -1)
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Entrée Molécule λexcitation
(nm) λemission (nm) Δλ (nm) ε (M-1.cm-1) φ 1 T01 270 422 152 38870 0,014 2 T02 269 423 154 34856 0,14 3 T03 274 412 138 30238 0,008 4 T05 265 405 140 40725 0,101 5 T09 365 501 136 38604 0,005 6 T10 276 405 129 35533 0,009 7 T12 263 382 119 28634 0,201 8 T13 262 508 246 27605 0,203 9 T15 270 377 107 22243 0,013 10 T16 275 378 103 12046 0,026 11 T17 278 372 94 30390 0,01
Schéma 2.53 : Propriétés de fluorescence des triazoles dans l’acétonitrile.
Les coefficients d’extinction molaire sont compris entre 40000 M-1.cm-1 et 20000 M-1.cm-1. Le plus haut est celui du T05 pour 40725 cm-1 et le plus faible est celui du T16 pour 12046 M
-1
.cm-1. Ils absorbent beaucoup plus qu’ils n’émettent ce qui induit des rendements quantiques faibles voir très faibles pour certains. Les triazoles T12 et T13 montrent des rendements quantiques d’environ 20% et d’autres comme le triazole T09 n’atteigne que 0,5%. Ce faible rendement quantique serait lié au mécanisme de fluorescence. En effet, le phénomène de l’ESIPT fait intervenir un changement de forme tautomère de la molécule en raison d’un transfert de proton. Ce type de transfert non radiatif utilise la majorité de l’énergie de relaxation de la molécule. La différence d’énergie restante permet la relaxation radiative fluorescente.
La différence mesurée entre les spectres de fluorescence dans l’acétonitrile et le DCM a été rationalisée par les calculs théoriques et la conformation de la molécule dans ces différents solvants. A l’état fondamental, nous avons une liaison hydrogène intramoléculaire entre le proton de la fonction alcool et l’atome d’azote du triazole d’environ 1,84 Å. La modélisation en solvant explicite montre la rotation du fragment pyridol, éloignant ainsi le proton du centre triazole, empêchant l’ESIPT. Les calculs en solvant implicite pour le DCM ne
113 convergent pas pour le moment. Cet écart entre les spectres dans l’acétonitrile et le DCM démontre un ESIPT, corroboré par les mesures des spectres d’excitation du triazole T16. Ce transfert de proton à l’état excité augmente le déplacement de Stokes d’environ 100 nm pour tous les 1,2,4-triazoles sauf pour le T09 pour lequel nous n’observons pas de modifications. Les cas particuliers des triazoles T09, T12 et T13 peuvent s’expliquer par la présence de la fonction alcyne qui intervient dans la fluorescence et doit donner lieu à des effets électroniques prépondérants dans leur fluorescence.
La fluorescence est globalement neutralisée en milieu aqueux. Cette neutralisation est certainement due aux interactions intermoléculaires avec le solvant qui donnent lieu à des phénomènes non radiatif. Il existe cependant quelques triazoles dont la fluorescence n’est pas neutralisée, les triazoles T10, T15, T16, T17. Ces molécules montrent une nouvelle bande fluorescente vers les 430 nm qui pourrait s’expliquer par un transfert de proton à l’état excité intermoléculaire avec l’eau. Cette hypothèse doit être évaluée par de futures analyses.
Enfin, nous avons pu mettre en relation le déplacement de Stokes avec la longueur d’onde d’émission pour créer un outil de prédiction de fluorescence dans le cas où de nouveaux triazoles seraient imaginés.
L’objectif de ces travaux était de synthétiser trois nouvelles sondes fluorescentes pour la biologie. Cependant, toutes les analyses de fluorescences démontrent que même si les propriétés photophysiques des triazoles synthétisés sont intéressantes (ESIPT, solvant et pH dépendants..), il serait difficile d’obtenir 3 fluorophores à base triazole de couleurs différentes avec des rendements quantiques acceptables pour les utiliser en 2D-Oxy DIGE. Les longueurs d’onde d‘absorption sont toutes comprises entre 260 et 280 nm sauf le T09 qui absorbe à 365 nm. L’absorption dans l’UV est un problème pour une sonde fluorescente car nous nous trouvons dans une zone d’absorption des tissus biologiques dont les longueurs d’onde d’émission sont comprises entre 400 et 500 nm. On observe généralement 2 bandes d’émissions dues à l’équilibre tautomérique entre les formes enol et ceto qui interviennent pendant l‘ESIPT. La fluorescence est neutralisée dans l’eau ce qui ne nous permet pas de les utiliser en milieu biologique.
Des calculs théoriques ont été réalisés pour compléter les résultats expérimentaux. Nous avons réalisé des mesures d’absorption et d’émission dans différents milieux pour mettre en
114 évidence ce mécanisme de fluorescence et nous avons pu mesurer les rendements quantiques pour déterminer l’efficacité des fluorophores.
Avec toutes ces informations, nous avons conclu qu’il serait compliqué de déterminer une structure synthétisable qui posséderait les propriétés de fluorescence désirées. Les rendements quantiques sont trop faibles malgré les déplacements de Stokes supérieurs à 150 nm. Nous allons donc tenter de répondre aux problématiques du projet à travers la synthèse d’autres molécules fluorescentes de la famille des BODIPY, des molécules moins originales que les triazoles mais connues pour être faciles d’accès avec de hauts rendements quantiques mais peu décrit avec des fonctions hydrazides.
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Chapitre III
Synthèse de nouvelles sondes
fluorescentes de type BODIPY pour la
détection de protéines carbonylées
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