Les quantum dots comme sondes biologiques dans le mécanisme de FRET FRET

L’imagerie de fluorescence ne suffit pas quand on souhaite étudier les interactions biochimiques qui se font à une distance entre 1-100Å. Il nécessite d’avoir un outil à haute résolution qui permet de sonder ces distances nanométriques. Une technique simple largement utilisée en biologie cellulaire est le transfert d’énergie de type Förster (FRET). Décrit par Theodore Förster en 1948, le FRET est un transfert d’énergie non-radiatif par interaction coulombienne sans transfert d’électron entre un donneur et un accepteur qui sont séparés d’un distance r ≤ 10nm. Il y a transfert d’énergie entre le donneur et l’accepteur si le spectre d’émission du donneur recouvre une partie du spectre d’excitation/absorption de l’accepteur. La figure 1.14 est un exemple de FRET entre la fluorescéine et la rhodamine.

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Figure 1.14 : Représentation schématique du FRET entre la fluorescéine (donneur) et la rhodamine (accepteur) séparés d’une distance r. 83

La distance r, le rendement quantique du donneur et le recouvrement (J(λ)) des spectres sont autant de paramètres qui influencent le taux de FRET, kFRET. Ce dernier est défini par l’équation (1.6) :

(1.6)

Où τD est le temps de vie de fluorescence du donneur en l’absence de l’accepteur. r est la distance donneur-accepteur.

R0est la distance de Förster où l’efficacité du FRET est à 50% et r=R0

On peut aussi définir l’efficacité du FRET, ηFRET, par l’équation (1.7) :

(1.7)

41 Figure 2.14 (left) showing the basic principle of FRET. In spectroscopic terms, there should be a spectral overlap between the donor emission and the acceptor absorption spectra (Figure 2.14 right).

The degree of spectral overlap, the quantum yield of the donor, the relative transition dipoles orientation of the donor and acceptor, and the distance between the donor and acceptor molecules, directly affect the rate of energy transfer. The rate of energy transfer (or FRET transfer rate), _𝐸𝑘_{𝐹𝑅 𝑇}, is given by Equation 2.4 and we can observe a strong distance dependency which is proportional to r-6.

𝑘_{𝐹𝑅𝐸 𝑇} ¹

𝜏_𝐷 𝑅0

𝑟 (2.4)

where 𝜏_𝐷 is the excited-state lifetime of the donor in absence of the acceptor;

𝑅0 is the Förster distance representing a transfer efficiency of 50 %; r is the donor-to-acceptor distance.

Figure 2.14. (Left) Simplified Jablonski diagram representing the energy levels of the donor (D) and acceptor (A) molecules. The donor is brought to an excited state (D*) from an electronic ground state (D) by light excitation (h ), followed by inner relaxation (dotted arrows) to an excited electronic ground state and finally to the ground state by radiative decay (kD), non-radiative decay (kD-NR) or FRET (kFRET, dashed lines referring to possible resonant transitions). FRET (horizontal lines with dots on each end) occurs when the energy levels of D* and A are in resonance. After FRET, the acceptor is in an excited state (A*), followed by radiative decay (kA) and non-radiative decay (kA-NR) to its ground state. (Right) Spectral overlap (grey) between the donor emission (blue) and the acceptor absorption (A). The integral of this overlap is calculated using Equation 2.6.

From Equation 2.4, 𝑅0 expressed in nm, which is characteristic to a donor-acceptor pair, can be calculated at equilibrium where the FRET efficiency (_𝐸𝜂_{𝐹𝑅 𝑇}) = 50%, giving rise to Equation 2.5 which encompasses several crucial variables including the overlap integral J( ).

Chapitre 1 : Généralités

L’équation (1.7) montre que l’efficacité du FRET dépend de la distance donneur-accepteur. Le processus FRET affecte les propriétés optiques du donneur et résulte en une baisse de l’intensité de luminescence I et du temps de vie de fluorescence (τ). On peut ainsi écrire plus simplement l’équation (1.7) en fonction des propriétés optiques du donneur en présence et en l’absence de l’accepteur (équation (1 .8)) qui sont mesurables expérimentalement. L’accepteur peut soit atténuer la fluorescence du donneur soit l’éteindre complètement.

(1.8) Où IDA est l’intensité de fluorescence du donneur en présence de l’accepteur

ID est l’intensité de fluorescence du donneur en l’absence de l’accepteur. τDA est le temps de vie de fluorescence du donneur en présence de l’accepteur. τD est le temps de vie de fluorescence du donneur en l’absence de l’accepteur.

Les QDs binaires ont été les premiers à être utilisés comme sondes biologiques avec le mécanisme de FRET. Medintz et al.84 ont utilisés des QDs de CdSe/ZnS fonctionnalisés avec la protéine MBP (maltose-binding protein) qui est un récepteur du maltose en milieu biologique. En présence de maltose, l’intensité de fluorescence du QD diminue et dépend de la quantité de maltose dans le milieu. Xia et al.85 ont mis en place une sonde de TNT (2,4,6-trinitrotoluène) en présence de QDs de CdSe/ZnS et de nano-bâtonnets d’or qui sont des suppresseurs de luminescence. En l’absence de TNT, les QDs sont attachés aux nano-bâtonnets d’or par l’interaction des ligands et il n’y a pas de fluorescence. En présence de TNT, les QDs sont enlevés de la surface et retrouvent leur fluorescence. Goldman et al.86 ont fait une étude similaire en replaçant les nano-bâtonnets d’or par un fluorophore organique. Une sonde FRET a été mise en place pour la détection de l’hormone estradiol par Long et al.87 en utilisant les QDs comme donneurs et le fluorophore Cy 5.5 comme accepteur. Le couple lanthanide (donneur)-QDs (accepteur) a aussi été étudié et résumé dans la revue de Cardoso Dos Santos et al.88 Il est surprenant d’avoir autant d’études sur les composés binaires toxiques et une seule sur les QDs d’AgInS2 malgré sa non-toxicité. Evstigneev et al.89 ont récemment démontré le mécanisme de FRET en utilisant les QDs d’AgInS2/ZnS comme donneurs et les QDs CdSe/ZnS comme accepteurs. Pour aller plus loin, on pourrait envisager des études plus poussées similaires à celles faites avec les QDs binaires et plus spécifiquement avec l’AgInS2 qui présente une meilleure luminescence et un temps de vie plus long que le CIS comme le sera démontré dans les chapitres 2 et 3 suivants.

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Chapitre 2 : Les composés Cu-In-S et Cu-In-S-Se