Quantification de la teneur des ARNm par RT-PCR quantitative en temps réel

A. Recommandations

La PCR quantitative en temps réel permet de mesurer la teneur d’une molécule d’acide nucléique particulière dans un extrait d’ADN. La sensibilité de cette technique rend nécessaire de prendre un certain nombre de précautions, notamment lors de l’étude des transcrits.

Tout d’abord, comme les transcrits dosés par PCR quantitative sont souvent peu abondants, l’absence de contamination par de l’ADN génomique dans l’échantillon d’ARN est cruciale. Il est donc important d’obtenir un échantillon d’ARN exempt d’ADN par le biais, par exemple, de la dégradation de l’ADN résiduel par une ADNase « RNAse free » et de le vérifier en testant par exemple l’absence d’amplification par PCR d’un intron d’un gène ubiquitaire.

Par ailleurs, l’importance des familles de gènes dans le génome d’A. thaliana et celui des autres plantes influence la stratégie de sélection des amorces pour la PCR quantitative en temps réel. En effet, certains paralogues présentent des séquences si proches qu’un couple d’amorces pourrait amplifier deux gènes. Ainsi, lors de la sélection des amorces, l’attention doit être portée sur la spécificité des couples vis-à-vis de leur gène cible. Pour cela, le recensement de l’ensemble des gènes formant la famille étudiée est primordial.

D’un point de vue technique, la présence d’une gamme-étalon complète sur chaque plaque permet d’une part, de contrôler la reproductibilité des mesures et d’autre part, de s’affranchir de la variation de l’efficacité d’un couple d’amorces à l’autre, autorisant ainsi la comparaison du niveau d’expression de deux gènes. Dans le même but, les couples d’amorces doivent présenter une efficacité d’amplification homogène au plus proche de 100%.

Il a été montré l’intérêt de réaliser la mesure du même gène de référence sur chaque plaque, en parallèle du(des) autre(s) gène(s) mesuré(s), comme témoin positif de la réaction de PCR quantitative et contrôle de la qualité de la gamme et des échantillons.

Enfin, il est judicieux de tester plusieurs quantités différentes de chaque échantillon pour s’assurer de la linéarité de la gamme des mesures. Les mesures retenues doivent, pour être comparées, être proportionnelles à la quantité initiale d’échantillon.

B. La normalisation des résultats

La normalisation des niveaux de transcrits permet de faciliter la comparaison des résultats d’un échantillon à l’autre. D’après Bustin (2002), la normalisation la plus appropriée est de ramener au nombre de cellules ou à la quantité totale d’ARN. J’ai retenu cette deuxième proposition pour présenter mes résultats.

Lorsque l’étape de RT est réalisée avec des hexamères aléatoires, de nombreux auteurs utilisent comme référence normalisatrice le niveau des ARNr 18S (Itoh et al., 2001; Goda et al., 2002; Klok et al., 2002; Teramoto et al., 2002; Hammond et al., 2003; Liu et al., 2003; Ogawa et al., 2003; Shimada et al., 2003; Stasolla et al., 2003) et 28S (Choi et al., 2002). Cependant, les ribosomes sont très abondants dans la cellule, et la normalisation du niveau de transcrits par rapport aux ARNr, surtout quand il s’agit de gènes faiblement exprimés, risque d’entraîner un biais. De plus, comme les ARNr et les ARNm sont transcrits par différentes ARN polymérases, leur niveau sont indépendants et peuvent varier dans certains mutants ou conditions physiologiques (Bustin, 2002).

Les gènes de maintenance ne sont pas plus appropriés, sauf cas particuliers, car leur expression varie trop souvent d’une condition à l’autre. Par exemple, il a été montré que le niveau des transcrits du gène d’actine ATC2 est réduit de 50% quand les plants d’A. thaliana sont soumis à un choc thermique en les passant de la température ambiante à 37°C alors qu’aucune variation n’est observée en les transférant à 44°C (Volkov et al., 2003). Par contre, le niveau de transcrits du gène codant la protéine ribosomique L23 est réduit lors du passage à 44°C (Volkov et al., 2003). Les gènes de maintenance n’adoptent donc pas le même comportement face au même stress. Par conséquent, il est nécessaire de vérifier si l’expression du gène constitutif choisi n’est pas modifiée par les traitements réalisés, comme l’ont fait par exemple Harari-Steinberg et al. (2001) pour le gène d’ubiquitine UBQ10 pendant la croissance de jeunes plantes d’A. thaliana à la lumière et à l’obscurité. Pourtant, de nombreux auteurs normalisent par rapport à des gènes « constitutifs » par exemple des gènes codant des protéines du cytosquelette comme l’actine (Charrier et al., 2002; Zheng et al., 2002 et d’autres; Chae et al., 2003; McGinnis et al., 2003) et la tubuline β (Mladek et al., 2003) ou encore le facteur d’initiation de la traduction eIF4A1 (Bonaventure et al., 2003), le facteur d’élongation EF1α (Collakova & DellaPenna, 2003; Foucher et al., 2003) et les gènes

d’ubiquitine UBQ2 (Itoh et al., 2001) ou UBQ10 (Harari-Steinberg et al., 2001; Wang et al., 2003b). Dans une étude de la famille des transporteurs de nitrate NTR, Orsel et al. (2002a) ont utilisé le gène AtAPT1 (adénine phosphoribosyl transférase 1) pour normaliser leurs résultats. Vandesompele et al. (2002) proposent dans une discussion sur la normalisation des résultats de PCR quantitative d’utiliser plusieurs gènes. Jacobs et al. (2003) ont illustré l’utilisation simultanée de trois gènes constitutifs pour normaliser l’expression de gènes de glucane synthases dans des plants d’A. thaliana transformées par une construction RNAi.

La majorité des ARN hélicases présentent un profil similaire et peu variable. Ces gènes sont donc de bons candidats de contrôle interne. De plus leurs niveaux d’expression varient de moyen à très faible par rapport à d’autres gènes de maintenance comme EF1α, permettant de choisir un gène AtRH exprimé à un niveau proche du gène à normaliser, évitant l’écueil des ARNr, trop abondants.

C. Sensibilité et spécificité

La diversité des systèmes de détection, des différents modèles de machines, des différentes méthodes de calculs et de normalisation des résultats, rend difficile la comparaison des résultats obtenus par différentes équipes. De plus, la plupart des auteurs donnent des valeurs relatives par rapport à un gène contrôle ou à une condition de référence. Or, seule l’indication des valeurs absolues permet de comparer les mesures des différentes expériences. Bustin (2002) insiste sur le fait qu’il reste peu d’améliorations à apporter à la technique de PCR quantitative mais que le manque d’homogénéité dans le mode opératoire augmente la difficulté de comparer les résultats entre différentes équipes. Il pose la question de savoir combien la RT-PCR quantitative est réellement quantitative, reproductible et informative, question que nous avons voulu aborder dans notre travail.

1. Sensibilité

La gamme des mesures possibles en PCR quantitative s’étend de quelques dizaines de molécules à plusieurs millions, couvrant une amplitude de 10⁵ à 10⁷ selon les auteurs. L’étendue de cette gamme couvre la majeure partie des conditions rencontrées en physiologique végétale. Par exemple, il est possible de mesurer des variations de gènes inductibles comme le gène PR1 (Schenk et al., 2003), fortement induit lors d’attaques par des pathogènes et utilisé comme marqueur en phytopathologie.

Au cours de mon travail, j’ai pu évaluer la spécificité et la sensibilité de la PCR quantitative en temps réel. Dans les conditions dans lesquelles je me suis placée, la sensibilité de la PCR quantitative est de l’ordre de 20 eg.ng^-1 ARN totaux. Cet ordre de grandeur de la sensibilité est cohérent avec ceux présentés dans la littérature. Dans leur étude sur la famille des gènes AtARI, Mladek et al. (2003) donnent comme limite de sensibilité 5 copies.ng^-1 soit environ 10 eg.ng^-1 ARN totaux. Pour cette famille, la limite de la sensibilité de la technique est atteinte : l’expression de seulement la moitié des gènes est mesurable par PCR quantitative en temps réel. Pour l’autre moitié, le signal enregistré se situe au niveau du bruit de fond et ne permet pas de trancher entre absence d’expression ou faible expression. La sensibilité de la PCR quantitative en temps réel permet l’étude de gènes très faiblement exprimés.

Il faut rappeler que les mesures à la limite de la sensibilité, comme les autres, ne sont valables que lorsque la quantité de transcrits mesurée est proportionnelle à la quantité d’échantillon mesurée. De plus, bien que la sensibilité soit, à première vue, uniquement limitée par le dépôt d’une quantité suffisante de matrice pour réaliser la mesure, un excès de matrice peut être tout aussi préjudiciable. En effet, comme la PCR est une réaction enzymatique, elle est soumise à l’inhibition par excès de substrat. En déposant une quantité trop importante de matrice, l’amplification risque de ne pas se dérouler dans des conditions optimales. Par ailleurs, des inhibiteurs de PCR peuvent être présents dans les échantillons dans une proportion variable. Dans ce cas également, plus la quantité d’échantillon déposée est importante, plus l’amplification de la PCR risque d’être inhibée. Nous avons observé ce phénomène en comparant différents extraits d’ADN génomique.

Théoriquement, il n’y a pas de limite maximale de la mesure de l’expression, car la dilution de l’échantillon jusqu’à des valeurs mesurables est toujours possible.

2. Spécificité

La spécificité d’une technique se définit par sa capacité à générer le moins possible de résultats « faux positifs ». Dans notre cas, cela correspond à obtenir une valeur supérieure au bruit de fond de la mesure d’une expression nulle. Un vrai résultat négatif correspond à une valeur appartenant au bruit de fond lorsqu’un gène n’est pas exprimé. Parmi mes résultats, seul le gène SUP1 présente dans certains échantillons des mesures se confondant avec le bruit de fond. Pour estimer la spécificité de la PCR quantitative en temps réel, j’ai comparé mes résultats avec ceux de la littérature. Il a été montré par hybridation in situ et par détection de l’expression de gènes rapporteurs que l’expression du gène SUP1 est limitée à certains tissus de la fleur et de la graine (Sakai et al., 1995; Meister et al., 2002; Ito et al., 2003). Par

RT-PCR quantitative, son expression a été mesurée uniquement dans les bourgeons floraux, les fleurs et les siliques. Dans les autres organes, les mesures obtenues se confondent au bruit de fond (Charrier et al., 2002; Mingam et al., 2004). Cet exemple montre que la PCR quantitative est au moins aussi spécifique que les autres méthodes d’études de l’expression transcriptionnelle.

Tableau 14 Valeurs minimale et maximale des mesures obtenues par RT-PCR quantitative en temps réel au cours de ce travail.

Les valeurs sont exprimées en équivalents-génome par nanogramme d’ARN totaux.

Expression minimale 20 eg.ng^-1 Expression maximale 85 000 eg.ng^-1

Bruit de fond < 20 eg.ng^-1

D. Comparaison de la RT-PCR quantitative au Northern blot

1. Sensibilité

Lorsque les gènes sont exprimés à de très faibles niveaux, la méthode de RT-PCR est souvent préférée au Northern blot. Certains gènes LeACS, au départ considérés comme non exprimés au vu des résultats d’expériences de Northern blot ou de protection à la ribonucléase, ont montré un niveau extrêmement bas de transcription, et pourtant mesurable par RT-PCR en temps réel (Balbi & Lomax, 2003).

Lorsque les gènes à étudier sont suffisamment exprimés et leur séquence suffisamment différente, il peut être plus avantageux de réaliser l’analyse de leur expression par Northern blot plutôt que par RT-PCR quantitative, du moins si l’on se place dans une perspective marchande, tenant compte du coût de l’expérience. Kursteiner et al. (2003) ont fait ce choix pour étudier l’expression des gènes AtALDH en conditions d’anoxie chez A. thaliana. Par contre, ils ont utilisé la RT-PCR quantitative en temps réel pour étudier l’expression des gènes PDC dont l’expression de trois d’entre eux n’est pas détectable par Northern blot. Comme l’analyse de l’expression par PCR quantitative demande de faibles quantités d’ADNc (10 à 200 ng comparés à environ 10 à 20 µg pour un Northern blot), il est possible de suivre par RT-PCR quantitative l’expression de nombreux gènes à partir d’une simple extraction d’ARN, même si la quantité de matériel est limitée. Lake et Willows (2003) ont montré que la

PCR quantitative en temps réel nécessite 10 à 100 fois moins d’ARN qu’un Northern blot, pour obtenir des résultats d’expression similaires.

2. Spécificité

Lorsque les gènes présentent des séquences très proches, le phénomène d’hybridation croisée peut rendre le Northern blot totalement inapproprié pour l’étude de l’expression. Montrichard et al. (2003) ont ainsi remarqué que le signal plus fort observé en Northern blot par rapport à

celui observé en RT-PCR quantitative était dû à de l’hybridation croisée entre leur sonde et plusieurs transcrits appartenant à la même famille de gènes.

La RT-PCR quantitative peut venir compléter une analyse par Northern blot, notamment lorsque les séquences sont très proches (plus de 70% d’identité). Après une analyse de l’expression par Northern blot, Brown et al. (2003b) ont utilisé la RT-PCR quantitative pour distinguer l’expression du gène de réponse aux pathogènes PDF1-2 chez A. thaliana de celle de trois autres homologues.

3. Limites et complémentarités

Sauf dans de rares cas, la PCR quantitative en temps réel ne permet pas de détecter les événements d’épissage alternatif. En effet, les amorces utilisées pour la PCR quantitative risquent d’amplifier sans distinction les deux transcrits. Comme les fragments amplifiés en PCR quantitative sont courts (50 à 200 pb) et souvent à l’intérieur d’un même exon, l’épissage alternatif ne sera pas détecté et l’expression mesurée correspondra à la somme de la teneur des deux transcrits. Dans le cas où au moins l’une des amorces serait localisée à l’intérieur de la partie épissée, seul l’un des transcrits est amplifié. Lorsque les amorces se trouvent de part et d’autre du site d’épissage, il est possible que les deux produits soient amplifiés. Dans ce cas, la courbe de fusion indiquera la présence de deux produits PCR de Tm différentes, permettant d’émettre l’hypothèse d’un épissage alternatif. Cependant, il peut aussi arriver que seul le transcrit le plus court soit amplifié, ne permettant pas non plus le diagnostic d’un épissage alternatif. Ainsi, le Northern blot peut apporter des informations complémentaires importantes.

Par contre, si un épissage alternatif est mis en évidence par Northern blot, il est possible de suivre la fréquence de cet événement par RT-PCR quantitative en choisissant les couples d’amorces appropriés (Halterman et al., 2003).

Par ailleurs, lorsqu’une dégradation partielle des transcrits se produit, comme par exemple lors des études d’extinction de gènes (gene silencing), la RT-PCR quantitative est peu indiquée. En effet, basée sur l’amplification de courts fragments, la RT-PCR quantitative peut conduire à la comptabilisation de transcrits en cours de dégradation au moment de la mesure de l’expression. Dans ce cas et celui de l’épissage alternatif, la RT-PCR quantitative en temps réel ne doit pas être le seul outil utilisé pour étudier l’expression, et les données devraient être complétées par des analyses par Northern blot.

Il est extrêmement important de connaître l’ensemble des gènes d’une famille pour garantir la spécificité de l’analyse. Chez A. thaliana et les autres espèces dont le génome est entièrement séquencé, le recensement exhaustif des membres d’une même famille est assez aisément réalisable. Par contre, pour les génomes partiellement déchiffrés comme ceux de nombreuses espèces d’intérêt agronomique, il est difficile de ne pas avoir omis un gène. Chez le pois (Pisum sativum), la famille des NADPH/NADP-thiorédoxines TRX h compte au moins quatre membres. En réalisant en parallèle un Northern blot et une analyse de l’expression par RT-PCR quantitative en temps réel, Montrichard et al. (2003) ont étudié l’expression des gènes PsTRX h3 et PsTRX h4. Cependant, l’analyse du Northern blot réalisé avec la sonde correspondant au gène PsTRX h3 laisse supposer l’existence de deux transcrits de tailles différentes codés par ce gène (épissage alternatif) ou l’existence d’un cinquième gène dans cette famille. Ainsi, le Northern blot apporte des informations complémentaires aux résultats de RT-PCR quantitative en temps réel.

Enfin, il faut garder à l’esprit que les analyses de RT-PCR quantitative sont réalisées en général sur des organes entiers composés de différents tissus. Même si Philippar et al., (2003) ont réussi à comparer les profils d’expression de gènes codant des protéines formant des canaux à potassium au niveau de l’épiderme, du mésophyle et des tissus vasculaires des feuilles de Maïs par RT-PCR quantitative, des études de fusions de promoteurs à des gènes rapporteurs peuvent être nécessaires pour compléter la description du profil d’expression (Berger et al., 2002; Reintanz et al., 2002). La technique de microdissection au laser (Laser Capture Microdissection) permet d’isoler certaines cellules à partir de coupes de tissus (Emmert-Buck et al., 1996). Des protocoles spécifiques permettent ensuite d’extraire l’ADN et les ARN de ces cellules. Chez les mammifères, cette technique est employée en association avec la RT-PCR quantitative en temps réel (Bustin, 2002). Elle a été appliquée aux plantes pour réaliser des banques de transcrits spécifiques de certains types cellulaires comme le

phloème chez le Riz (Asano et al., 2002; Kerk et al., 2003). Cette technique a été combinée avec une analyse par microarrays pour identifier des gènes spécifiques de cellules épidermiques et vasculaires chez le Maïs (Nakazono et al., 2003).

E. Une technique complémentaire aux microarrays

Les microarrays permettent de regrouper les gènes sur la base de leur expression et d’identifier ainsi des gènes co-régulés ou présentant un même profil d’expression. La PCR quantitative en temps réel est la principale technique utilisée pour valider les résultats de microarrays. Rajeevan et al. (2001) ont montré que la validation dépend de l’intensité du signal d’hybridation. Plus le signal enregistré en microarrays est fort, plus il est probable de confirmer le changement d’expression du gène par PCR quantitative, surtout si le changement est supérieur à 4 fois entre les deux conditions d’hybridation. Ces auteurs notent également que seule la nature du changement (augmentation ou diminution) est validée, mais pas son amplitude. En effet, la PCR quantitative donne en général des facteurs de variations plus grands que ceux observés en microarrays (Rajeevan et al., 2001; Klok et al., 2002; Wang et al., 2003b; Wurmbach et al., 2003). D’une part, les phénomènes d’hybridation croisée peuvent se produire au cours des expériences de microarrays (Schenk et al., 2003). Ils expliqueraient une partie des différences observées entre les valeurs obtenues par microarrays, notamment dans le cas d’hybridation à de longs fragments d’ADN (ADNc, EST), et celles obtenues par RT-PCR quantitative. D’autre part, la saturation du signal est atteinte beaucoup plus rapidement avec les microarrays qu’avec la PCR quantitative. Enfin, les microarrays ne permettent d’étudier que l’expression des gènes les plus exprimés. Ainsi, la PCR quantitative est plus sensible et fiable sur une plus large gamme que les microarrays. Un autre avantage de la PCR quantitative par rapport aux microarrays, c’est l’accès à une mesure absolue de l’expression. En effet, les résultats de microarrays sont généralement exprimés en rapports d’activation ou de répression et il est difficile de comparer les résultats d’expression d’une expérience à l’autre.

Le SYBR Green® est plus utilisé que les sondes fluorogènes dans le cas de la validation de résultats de microarrays par RT-PCR quantitative car il est plus pratique et moins cher : il n’y a pas besoin de mise au point spécifique ni d’oligonucléotides supplémentaires (Rajeevan et al., 2001). Cependant, même si des plates-formes intégrées à haut débit proposent de coupler microarrays et PCR quantitative en plaque 384 puits (Wurmbach et al., 2003), la PCR

quantitative reste un outil de validation d’un petit nombre de gènes qui varie de trois à une cinquantaine selon les articles.