RT PCR Q
Variabilité
biologique Variabilité technique
3 gènes témoins 21 AtRH
Extr.
9 organesARN
35 éch.
ADNc
52 éch.
Produits PCR
4234 mesures
RT PCR Q
Variabilité
biologique Variabilité technique
3 gènes témoins 21 AtRH
Figure 6A Schéma de synthèse des mesures de l’expression de 24 gènes par RT-PCR quantitative en temps réel.
A chaque étape, le nombre d’échantillons obtenus et la nature de la variabilité introduite ont été précisés. Prél. : Prélèvement des échantillons végétaux ; Extr. : Extraction des ARN totaux ; PCR Q : PCR quantitative en temps réel ; Ech. : Echantillons.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 [1;2] ]2;3] ]3;4] ]4;5] ]5;6] ]6;7] ]7;8] ]8;9] ]9;10] PCR (n=2534) PCR+RT (n=65) PCR+RT+Echantillons (n=207) Pourc ent ag es
Valeurs des rapports
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 [1;2] ]2;3] ]3;4] ]4;5] ]5;6] ]6;7] ]7;8] ]8;9] ]9;10] PCR (n=2534) PCR+RT (n=65) PCR+RT+Echantillons (n=207) Pourc ent ag es
Valeurs des rapports
Figure 6B Variabilité des mesures de l’abondance des transcrits de 20 gènes AtRH, du gène EF1 alpha et des gènes ACT2/ACT8 mesurée par PCR quantitative en temps réel dans 9 organes différents d’A. thaliana.
Les mesures de PCR quantitative en temps réel ont été comparées entre elles pour évaluer l’impact de chaque étape du protocole sur la variabilité totale des résultats. Les rapports obtenus indiquent la variabilité introduite par la PCR (gris clair), celle introduite par la RT et la PCR (gris moyen) et la variabilité totale (gris foncé) des résultats. Ils ont été répartis en classes selon leur valeur. Le nombre total de comparaisons (n) réalisées pour chaque étape est indiqué entre parenthèses sur le graphique.
échantillon, 35 stocks indépendants d’ARN totaux ont été obtenus. Ces ARN totaux ont été convertis en ADNc par transcription inverse. Lorsque la quantité d’ARN d’un stock le permettait, l’étape de RT a été répétée jusqu’à 4 fois. Les 52 échantillons d’ADNc simple brin ainsi obtenus ont été utilisés directement comme matrice pour mesurer l’abondance des transcrits spécifiques des 24 gènes dans les différents organes, après une dilution adéquate (Figure 6A).
La variabilité introduite par l’étape de PCR quantitative, par l’étape de transcription inverse et par la préparation des échantillons biologiques a été évaluée en comparant deux à deux les mesures. Les rapports ainsi obtenus ont été répartis en différentes classes (Figure 6B).
La reproductibilité de l’étape de PCR quantitative a été évaluée en comparant les mesures de l’expression transcriptionnelle d’un gène réalisées sur le même échantillon d’ADNc. Ainsi, 2534 comparaisons ont pu être réalisées avec les données de 23 gènes différents. 2396 rapports (95%) sont compris entre 1 et 2 et 2485 (98%) entre 1 et 3. La variabilité introduite uniquement par l’étape d’amplification par PCR est donc très faible. En ce qui concerne les 49 rapports restants (1%), dont les valeurs sont supérieures à 3, le maximum atteint est de 7,8. Les données correspondantes ont été écartées de l’analyse finale.
Concernant la variabilité introduite par l’étape de transcription inverse, les mesures de l’abondance des transcrits sur les ADNc provenant de RT différentes réalisées sur le même stock d’ARN totaux ont été comparées. Les mesures de l’expression transcriptionnelle de 9 gènes dans différents organes ont permis d’établir 65 rapports différents. Leur répartition se révèle bimodale. 91% des rapports sont inférieurs ou égaux à 3 mais on observe une seconde population (6 rapports soit 9%) formant un pic centré autour de la valeur 4,5. La valeur maximale des rapports atteint 5,8. Ce pic correspond aux quelques valeurs aberrantes déjà présentes lors de l’étude de la marge d’erreur introduite par la PCR. Il n’est donc pas dû à un effet de la reproduction de l’étape de RT. Si l’on retire ces valeurs de l’analyse, 85% des rapports sont compris entre 1 et 2.
La variabilité associée à l’extraction n’a pas été estimée séparément de la variabilité biologique. Elles ont été estimées à partir l’expression transcriptionnelle moyenne de chaque gène dans les différents organes, les mesures obtenues à partir d’extractions réalisées en parallèle sur le même échantillon végétal ayant été rassemblées. L’ensemble des gènes n’a pas
été étudié dans l’ensemble des échantillons biologiques. Ainsi, 207 rapports ont pu être calculés à partir des données de 16 gènes et de 27 échantillons biologiques. 157 rapports (76%) sont compris entre 1 et 3. Les 50 rapports supérieurs à 3 se répartissent de façon décroissante jusqu’à la valeur 9,0. Ces rapports supérieurs à 3 proviennent de mesures effectuées essentiellement dans deux organes : les hampes florales et les feuilles caulines. Cela pourrait provenir d’une plus grande variabilité du développement de ces organes, rendant difficile l’estimation de l’état de différenciation des tissus et donc l’homogénéité des prélèvements.
Nous observons donc que lorsque l’expression transcriptionnelle d’un gène est estimée à partir des transcrits provenant d’une seule extraction, il y a 95% de chance que les mesures ne varient que d’un facteur 2. Par contre, lorsqu’on compare deux échantillons biologiques, on observe que 75% des mesures varient dans une gamme de 1 à 3. La marge d’erreur introduite par l’obtention des transcrits est supérieure à celle introduite par les réactions enzymatiques des deux étapes suivantes mais elle reste largement inférieure à la variabilité biologique. La variabilité technique étant inférieure à la variabilité biologique, l’ensemble de ce protocole permet donc de mesurer de façon fiable l’expression transcriptionnelle des gènes chez A. thaliana. De plus, nous pouvons affirmer, avec un seuil de confiance de 95%, que la variation d’un facteur 2 observée en routine entre deux mesures par PCR quantitative est non significative. En conséquence de cette analyse, nous avons décidé de mener notre étude comparative de l’expression trancriptionnelle de 20 gènes AtRH en utilisant un seul lot de plantes afin de nous affranchir de la variabilité introduite par la préparation de l’échantillon. De plus, pour cette étude, le niveau de transcrits d’AtRH4 a été utilisé pour détecter les éventuels problèmes au cours de l’étape de PCR et pour permettre la standardisation des données et faciliter leur représentation.
E. Qualité des échantillons
Les racines, les feuilles de la rosette jeunes et âgées, les hampes florales, les feuilles caulines jeunes et âgées, les bourgeons floraux, les fleurs et les jeunes siliques ont été prélevés sur 48 plants d’A. thaliana. Les ARN totaux ont été extraits de ces 9 organes et convertis en ADNc. Pour vérifier la qualité de ces 9 échantillons d’ADNc, plusieurs contrôles ont été réalisés par PCR quantitative en temps réel.
Tout d’abord, l’absence de contamination des échantillons par de l’ADN génomique a été vérifiée en analysant l’abondance d’un intron du gène AtSKα (iAtSKα). Les valeurs obtenues, largement inférieures au niveau d’expression le plus bas mesuré parmi les AtRH, appartiennent au bruit de fond (Tableau 8). Les échantillons sont donc exempts d’ADN génomique.
Ensuite, l’expression transcriptionnelle de deux gènes présentant des profils connus, constitutif pour EF1 alpha 4 (n° acc. X16432) et organe-spécifique pour SUPERMAN (SUP1, n° acc. U38946), a été mesurée dans ces mêmes échantillons.
Le gène EF1alpha 4, qui appartient à une famille multigénique de 4 gènes (Axelos et al., 1989; Liboz et al., 1990), est souvent utilisé comme contrôle constitutif (Mandel et al., 1995). Nous avons détecté des transcrits de ce gène dans tous les organes testés. Il présente une expression transcriptionnelle forte comprise entre 2.104 eg.ng-1 ARN totaux dans les feuilles caulines et 8,5.104 eg.ng-1 ARN totaux dans les racines.
Le gène SUP1, impliqué dans le contrôle du développement du méristème floral (Sakai et al., 1995), présente un faible niveau d’expression. Il est principalement exprimé dans les bourgeons floraux et les fleurs : 181 et 307 eg.ng-1 ARN totaux, soit 93% de l’expression totale. De plus, comme l’avaient précédemment observé Charrier et al. (Charrier et al., 2002), une faible expression (34 eg.ng-1 ARN totaux, soit 7% de l’expression totale) a été détectée dans les siliques. Cette expression est en accord avec la découverte du rôle de SUP1 dans le contrôle du développement des téguments de l’ovule chez A. thaliana (Meister et al., 2002). La présence des transcrits de SUP1 n’a pas été détectée dans les autres organes, tant dans les feuilles que les racines.
Tableau 8 Abondance des transcrits des gènes AtEF1α-4 et AtSUP1 et d’un intron du gène AtSKα (iAtSKα)
dans neufs organes d’A. thaliana (en eg.ng-1 ARN totaux). NS : non significatif.
R JF VF JC FC BF Fl Si T
AtEF1α-4 84301±16122 61696±10722 31971±5492 29325±5330 19875±6353 59120±25284 58170±13759 48501±7951 22189±7024
AtSUP1 NS NS NS NS NS 181±8 307±3 34±2 NS
V. Conclusion
Au cours de ma thèse, j’ai pu démontrer tout d’abord que la gamme dynamique des mesures des teneurs en transcrits par RT-PCR quantitative est très large : son amplitude maximale est de l’ordre d’un facteur 4000. En routine, la gamme utilisée permet de quantifier une différence de quantité d’un transcrit entre deux échantillons d’un facteur 150. D’autre part, la mesure de l’abondance des transcrits par RT-PCR quantitative est fiable et reproductible. La variation introduite dans les résultats par cette technique est largement inférieure à celle introduite par la variabilité biologique. Typiquement, la variation des mesures observée en routine est de l’ordre d’un facteur 2. De plus, la PCR quantitative permet de mesurer le niveau des transcrits et d’établir le profil d’expression transcriptionnel de gènes dont l’expression varie dans une large gamme d’intensité et de répartition selon les organes. La RT-PCR quantitative en temps réel apparaît comme l’outil le plus approprié pour l’analyse de l’expression transcriptionnelle d’une famille de gènes.