Afin d'estimer la quantité d'enzymes liées au support, un dosage protéique indirect a été réalisé. En déterminant la concentration d'enzymes de la solution résiduelle de l'étape de couplage des enzymes et en soustrayant celle-ci de la concentration initiale de cette même solution, il est possible d'estimer la quantité d'enzymes immobilisées (Belzil et al., 2004; Vinobaetal., 2011).
La concentration en protéines des solutions a été déterminée par la méthode de Bradford (Bradford, 1976). Il s'agit d'une méthode colorimétrique utilisant comme colorant le bleu de Coomassie. Lorsque le bleu de Coomassie est sous sa forme anionique (lié), c'est-à-dire lorsque que les molécules de colorant se lient aux acides aminés aromatiques (tyrosine, phenylalanine, tryptophane) et aux résidus hydrophobes présents à la surface des enzymes, il possède une absorbance maximale à une longueur d'onde de 595 nm. L'absorbance des solutions à 595 nm est donc proportionnelle à la quantité de protéines contenue dans les solutions.
Les tests Bradford ont été réalisés à l'aide de plaque multi-puits (96 puits) et d'un lecteur de plaque multi-puits EL808. Les concentrations en enzyme des solutions ont été déterminées en introduisant 200 uL de réactifs Bradford (Sigma-Aldrich) et 10 uL de solution dans chacun des puits et en déterminant l'absorbance de ces mélanges. La longueur d'onde utilisée pour les lectures a été de 595 nm. L'albumine de sérum bovin (BSA) a été utilisée comme standard.
Une droite d'étalonnage a été tracée en utilisant six concentrations différentes de BSA (0,25, 0,20, 0,15, 0,10, 0,05 et 0 mg/ml) obtenu par dilution d'un concentré de BSA (2 mg/ml) dans de l'eau ultra-pure (figure 29).
< CQ C o Ol u c o 0,27 0,24 0,21 0,18 0,15 0,12 0,09 0,06 0,03 0,00 y=0,5392x 0,2336 R2 = 0,9996 0 ,4 0,45 0,5 0,55 0,6 0,65 0,7 0,75 0,8 0,85 0,9 0,95 Absorbance (595 nm)
Figure 29. Droite d'étalonnage test Bradford (standard BSA).
3.4 Activité esterase
Le test d'activité esterase est un moyen relativement simple de vérifier l'activité enzymatique de l'hCA II. Ce test consiste à observer la vitesse à laquelle le pnitrophényl d'acétate (j»NPA) est hydrolyse en présence d'hCA II (48).
♦ HiO <-> NO> (48)
S
H J C — C I OH NO;Cette réaction a été observée par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 400 nm. La quantité d'enzymes actives immobilisée a été déterminée par la méthode proposée dans Belzil et al. (2004), qui consiste à déterminer la quantité équivalente d'enzyme liée de façon covalente sur la base de l'activité de l'enzyme libre. Donc, une droite d'étalonnage a été d'abord obtenue, reliant la vitesse de variation de l'absorbance (abs/min) en fonction de la concentration d'enzymes libres (ug d'hCA Il/ml) (figure 30). Les concentrations d'enzymes libres ont été déterminées par la méthode de Bradford.
8.E-02 n . 7.E-02 C «E 6,E-02 5.E-02
5
4,E-02 01 C 3.E-02 ra 3 O 2,E-02 O.E+00 y = 0,0104x + 0,015 R- = 0,9993 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 S 5,5hCA II libre (ug/ml)
Figure 30. Droite d'étalonnage, test d'activité esterase.
Les tubes de nylon sur lesquels les enzymes ont été immobilisées ont été coupés en plusieurs morceaux et introduits dans un bêcher afin de procéder au test d'activité esterase. Les résultats du test d'activité esterase permettent d'obtenir la vitesse de variation de l'absorbance (abs/min). En introduisant cette valeur dans l'équation de la droite d'étalonnage (figure 30) on peut déterminer la quantité d'enzymes actives immobilisées. L'activité esterase des enzymes libres a été observée à température ambiante dans une cuvette de 1 ml à l'aide d'un spectre-photomètre (X=400 nm) pendant cinq minutes. Le composant qui absorbe la lumière à 400 nm est l'ion p-nitrophénolate, soit la base conjuguée du p-nitrophényl (pKa à 25°C= 7,19). Dû au fait que la réaction se déroule dans une solution tampon Tris base / HC1 pH 8, plus de 85 % du p-nitrophényl est dissocié en ions p-nitrophénolate ce qui permet de suivre la réaction par spectrophotométrie. Le mélange réactionnel était composé de 0,8 ml de tampon Tris base (2-Amino-2- hydroxymethyl-propane-l,3-diol) /HC1 50 mM (pH 8), de 0,1 ml d'acétone contenant 5 mM de p-NPA et de 0,1 ml solution contenant des enzymes (0, 10, 20 et 50 ug d'hCA II) (Vinoba et al., 2011). L'activité esterase des enzymes immobilisées a été observée de façon similaire, 9 ml de tampon Tris base (2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-l,3-diol)/HCl 50 mM (j)H8) et 1 ml d'acétone contenant 5 mM de p-NPA ont été introduits dans un bêcher
agité magnétiquement. Des sections de tubes contenant des enzymes immobilisées ont été introduites dans le bêcher etl ml de mélange réactionnel a été prélevé chaque minute afin de déterminer l'absorbance et réintroduit ensuite dans le bêcher.
3.5 Hydratation catalytique du C()
2Montage expérimental
L'étude cinétique de la réaction d'hydratation enzymatique du CO2 a été réalisée en
utilisant l'Immobilized Enzymes Assay Device d'Olis (http://www.olisweb.com/Products/IEAD.html) auquel plusieurs modifications ont été apportées. Le montage est composé de deux pompes seringues reliées à deux seringues de verre correspondantes de 10 ml [1], un microréacteur [2], une cellule de détection [3], un spectrophotomètre [4] et un ordinateur pour l'enregistrement on-line des données [5] (figure 31). Le microréacteur utilisé est constitué par un tube de nylon 66 (L=90 mm, I.D-2,44 mm) contenant les enzymes immobilisées sur les parois internes et dans lequel des mixeurs statiques ont été introduits (figure 32).
Figure 31. Schéma de l'IEAD modifié
La cellule de détection est une cellule spectrophotométrique en écoulement continu qui permet de déterminer l'absorbance du liquide qui la traverse (figure 33). Dans la cellule de détection qui est en acier inoxydable et de forme cylindrique (I.D.= 19 mm, L=10 mm), le fluide s'écoule en direction axiale. La source lumineuse et le senseur sont situés aux extrémités de la cellule de détection. Les résultats expérimentaux obtenus sont présentés sous forme de concentration en bicarbonate des solutions sortant du microréacteur. Le modus operandi de ce montage est le suivant : l'une des deux seringues est remplie d'une solution aqueuse contenant du CO2 dissous, ainsi que l'autre contient une solution tampon auquel un indicateur coloré est ajouté; les deux pompes seringues sont ensuite actionnées (ratio 1:1) et l'absorbance de la solution sortant du microréacteur est mesurée à l'aide du spectrophotomètre et enregistrée en continu à l'ordinateur en utilisant un logiciel approprié.
Solution de C02
Les solutions saturées de CO2 ont été obtenues en absorbant du CO2 dans l'eau distillée pendant 30 min (Gibbons et al., 1963). Différentes concentrations en CO2 ont été obtenues en diluant les solutions saturées en CO2 avec de l'eau distillée dégazée (libre de CO2). Solution tampon
Les solutions tampon utilisées pour étaient toutes composées de n-méthylimidazole et ajustées au pH désiré avec de l'acide chlorhydrique. Le p-nitrophénol a été ajouté aux solutions à titre d'indicateur coloré. La force ionique de chacune des solutions tampon a été ajustée à 0,4 M avec du sulfate de sodium.
Méthode de détection
La méthode utilisée pour déterminer la quantité de bicarbonate à la sortie du microréacteur est celle décrite dans Khalifah (1971). Elle est basée sur le fait que la réaction d'hydratation du CO2 produit un ion bicarbonate et un proton, ce qui signifie que l'hydratation du CO2 contribue à la diminution du pH de la solution dans laquelle la réaction à lieu par l'ajout d'un proton pour chaque molécule de CO2 hydratée. Cette diminution de pH peut être déterminée par spectrophotométrie grâce à l'utilisation d'un indicateur de pH coloré. Le p-nitrophénol a été utilisé comme indicateur, pour un intervalle de pH allant de 4,9 (incolore) à 7,9 (jaune vif). Ce changement de couleur est du au fait que le p-nitrophénol (Xmax=310 nm) est incolore et que sa base conjuguée, l'ion p-nitrophénolate
(^max=400 nm), donne une coloration jaune aux solutions (figure 35). Lors des expériences,
la longueur d'onde du faisceau lumineux a été fixée à 400 nm, l'absorbance étant inversement proportionnelle à la quantité de molécules de CO2 hydratées. Afin de relier les mesures d'absorbance à une concentration de bicarbonate, une droite d'étalonnage a été obtenue sur la base des mesures d'absorbances prises pour différentes mélanges composés de solution tampon de n-méthylimidazole/H2S04 et de solution d'acide chlorhydrique dans
un rapport de 1:1. Ces lectures ont été effectuées en utilisant le montage expérimental décrit précédemment (IEAD modifié). Pour chaque solution tampon utilisée, une droite d'étalonnage a été tracée en déterminant l'absorbance des solutions résultantes du mélange
de la solution tampon et de solutions d'acide chlorhydrique de différentes concentrations (0, 3, 6, 9 et 12 mM) (figure 34). En soustrayant chacune des valeurs d'absorbance obtenues à la valeur d'absorbance du mélange 0 mM HCl/tampon on obtient des valeurs de Aabs. En connaissant la valeur du Aabs d'une solution il est possible de déterminer sa concentration en bicarbonate. 14 ■ 12 y » 26,661x R2 - 0,9989 £ 10- ' m 8 8- X </> 6 - -V o 3 .2. 4 m + X 2 - 0,00 0,10 0,20 0,30 Aabsorbance 0,40 0,50
Figure 34. Droite d'étalonnage, étude cinétique de l'hydratation catalytique du CO2 (tampon imidazole/H2S04 30 mM, pH 7,5) OH