Chapitre 2 : Matériel et méthodes
3. Techniques analytiques utilisées pour la caractérisation des échantillons après
3.4 Quantification du DOTA par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC)
La chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) est une technique analytique permettant de séparer des composés chimiques d’un mélange avant de les identifier et/ou de les quantifier. La séparation est fondée sur la distribution des solutés entre une phase mobile et une phase stationnaire. Les solutés dissous dans la phase mobile vont avoir une affinité avec la phase stationnaire dépendante de leur nature chimique et permettant ainsi leur séparation.[221– 223]
Pour séparer des composés polaires et hydrophiles tels que le DOTA et ses produits de dégradation, la chromatographie liquide en mode HILIC (Hydrophylic Interaction Liquid Chromatography) a été retenue [224]. Ce mode de séparation met en œuvre une phase stationnaire polaire et une phase mobile majoritairement composée de solvant organique et d’une faible quantité d’eau [225–227]. La phase mobile contient généralement des sels de type acétate ou formate d’ammonium qui jouent un rôle important dans les interactions électrostatiques entre les solutés chargés et la phase stationnaire. Cette phase stationnaire est composée de silice greffée par des fonctions diols (groupements silanols) interagissant par liaisons hydrogènes avec des molécules d’eau, formant une couche d’eau à la surface de la phase stationnaire. Lors de l’élution, les composés les plus polaires auront une affinité plus forte avec la couche d’eau adsorbée à la surface de la phase stationnaire, ils seront donc plus retenus que les composés apolaires et hydrophobes.
Les analyses de quantification du DOTA par chromatographie liquide ont été réalisées par E. Makombe au cours de son stage de Master 2 au Laboratoire d’Interaction Ligand-Actinide (LILA) du CEA Marcoule.
Le chromatographe utilisé est un Ultimate 3000 HPLC de Thermo Fisher Scientific couplé à un spectromètre de masse à ionisation électrospray (ESI-MS) micrOTOF-Q II de Bruker Daltonik à Marcoule. L’échantillon à analyser est injecté manuellement au moyen d’une boucle d’injection de 20 µL et élué par la phase mobile jusqu’au spectromètre de masse. La colonne retenue pour ces analyses est une colonne Interchim de type DIOL : Uptisphere OH (150×2,1mm ; ∅ 6 µm). La phase mobile est constituée d’un mélange acétonitrile/phase aqueuse 77/23 %vol. La phase aqueuse contient 20mM d’acétate d’ammonium. L’élution des analytes par la phase mobile a été réalisée en mode isocratique. Avant injection, les échantillons sont dilués dans l’eau pour obtenir une concentration d’environ 10mM, puis une nouvelle fois dilués dans un mélange acétonitrile/eau 80/20 %vol (25 µL de solution à 10mM dans 2 mL du mélange acétonitrile/eau).
L’utilisation d’un spectromètre de masse comme détecteur permet de suivre spécifiquement les ions de la molécule à étudier et de l’étalon interne choisi. Le mode d’ionisation négatif a été retenu pour cette étude. Une droite d’étalonnage a été réalisée en utilisant le DTPA comme étalon interne. La droite d’étalonnage pour quantifier le DOTA est représentée Figure 61 et a été réalisée en intégrant l’aire correspondant au suivi des ions de m/z = 403 et m/z = 392 correspondant aux
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DOTA et DTPA déprotoné. La concentration de DTPA est constante (0,2mM) et la concentration de DOTA varie de 0,025 à 0,375mM.
Figure 61 : Droite d’étalonnage en intégrant les ions caractéristiques du DOTA (m/z = 403) et du DTPA (m/z = 392). Concentration de DOTA variant de 0,025 à 0,375mM et concentration de DTPA de 0,2mM
utilisé comme étalon interne.
Avant analyse, les échantillons de DOTA irradiés ont été conservés au réfrigérateur à une température de 4°C. L’incertitude sur les concentrations de DOTA a été évaluée à environ 20%. Même si cette incertitude est importante, cela permet d’avoir un ordre de grandeur des concentrations de DOTA dans les échantillons après irradiation.
3.5 Systèmes de DOTA irradiés et techniques analytiques associées
Pour étudier la dégradation radiolytique du ligand DOTA, différents systèmes chimiques comme le DOTA sous forme solide, DOTA dans l’eau, DOTA dans l’acide nitrique, DOTA en présence de néodyme ou d’américium ont été irradiés par radiolyse gamma ou alpha. Les solides ou les solutions de DOTA irradiées ont ensuite été caractérisés par les différentes techniques analytiques décrites dans les parties précédentes. Le Tableau 14 récapitule les techniques analytiques employées pour chacun des systèmes de DOTA irradiés. Pour les solutions de DOTA irradiées en cyclotron par radiolyse alpha, des doses comprises entre 0 et 25kGy et des concentrations de ligand allant de 0,001 à 0,1M ont été mises en œuvre afin de déterminer les rendements radiolytiques initiaux d’espèces formées en solution comme H2O2 ou HNO2 par dosages colorimétriques et des gaz de radiolyse comme H2 ou CO2 par µGC. Dans le but d’identifier les produits de dégradation du ligand, certains échantillons ont également été irradiés à des doses plus importantes, jusqu’à 1MGy par radiolyse gamma et entre 100 et 130kGy par radiolyse alpha. Ces échantillons fortement irradiés ont ensuite été caractérisés par spectrométrie de masse (ESI-MS et MS gaz), chromatographie liquide (HPLC-MS), spectrophotométrie UV-visible, spectroscopies IR et RMN, et analyse du Carbone Organique Total en solution.
111 Systèmes [DOTA] ou [DOTA-M] (mol.L-1) Type de rayonnement
Techniques analytiques employées Dosage 𝐇𝟐𝐎𝟐 Dosage 𝐇𝐍𝐎𝟐 µGC ESI- MS MS gaz UV- visible IRTF HPLC- MS RMN COT DOTA solide - gamma DOTA eau 0,1 gamma DOTA eau 0,001 / 0,01 / 0,05 / 0,1 alpha DOTA 𝐇𝐍𝐎𝟑 0,1M 0,001 / 0,005 / 0,01 / 0,05 / 0,1 alpha DOTA 𝐇𝐍𝐎𝟑 1,0M 0,001 / 0,01 / 0,05 / 0,1 alpha DOTA- Nd 0,01 gamma DOTA- Nd 0,001 / 0,01 / 0,02 / 0,04 alpha DOTA- Am RL/M=5 alpha
Tableau 14 : Tableau récapitulatif des solutions de DOTA irradiées dans différents milieux par rayonnement gamma et alpha. Le symbole de coche vert signifie que la technique analytique a été employée pour caractériser la solution irradiée. M = néodyme (Nd(III)) ou américium (Am(III)),
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Conclusion
Par rapport aux études de radiolyse par introduction directe d’actinide dans la solution, la radiolyse externe de solutions aqueuses de DOTA au moyen d’un faisceau d’hélions (4He2+) fournit par les cyclotrons du CEMHTI (CNRS) à Orléans et ARRONAX à Nantes ainsi que par rayonnement gamma grâce à l’irradiateur Gammatec (STERIS) à Marcoule permet en première approche de simplifier l’étude de la dégradation radiolytique du ligand DOTA grâce à plus de souplesse dans la manipulation des solutions. Cette approche permet également de s’affranchir de la réactivité éventuelle d’un cation actinide avec les produits formés. Par ailleurs, l’utilisation de plusieurs outils donne accès à une grande gamme de TEL allant de 0,23 keV.µm-1 pour une irradiation gamma au 60Co, en passant par 20 à 100 keV.µm-1 pour les irradiations en cyclotrons et pouvant aller jusqu’à 130 keV.µm-1 dans le cas d’irradiation interne en présence de 241Am. Une telle gamme permet d’étudier l’effet de TEL sur les produits de radiolyse formés.
Les irradiations aux cyclotrons du CEMHTI et d’ARRONAX permettent de délivrer des doses variant de 0 à 25 kGy correspondant à des irradiations sous faisceau d’hélions allant jusqu’à 10 minutes. Dans ces conditions, il est possible de déterminer les rendements radiolytiques de formation de différentes espèces (G(H2), G(CO2), G(H2O2), G(HNO2)). La comparaison des rendements obtenus pour différents systèmes chimiques (eau, DOTA dans l’eau, DOTA dans l’acide nitrique, DOTA en présence de nitrate de néodyme en solution) donnera des indications sur les mécanismes mis en jeu lors de la dégradation du ligand DOTA. L’irradiation interne par introduction d’américium directement dans la solution a permis de dégrader le ligand DOTA avec des doses allant jusqu’à 88 kGy. Lors de ces études réalisées en boîte à gants, il a été possible de déterminer G(H2) et G(CO2) et de les comparer aux données obtenues par irradiation externe en cyclotrons.
Lors de ces études, les produits de dégradation issus du DOTA sont généralement présents en faible concentration, il est difficile dans ces conditions de les identifier. Par conséquent, la deuxième partie de ce travail concerne l’identification des produits de dégradation du ligand DOTA après irradiation des échantillons avec des doses allant de 100 à 130 kGy pour les irradiations alpha en cyclotron, jusqu’à 1 MGy pour les irradiations gamma et 113 kGy pour les irradiations par introduction d’américium dans la solution. Pour ces études, la spectrométrie de masse à ionisation électrospray (ESI-MS) a été le principal outil utilisé. La comparaison des différents produits de dégradation identifiés pour les différents systèmes chimiques étudiés permettra de proposer des chemins de dégradation pour le ligand DOTA en fonction de la composition chimique du milieu.
Les prochains chapitres du manuscrit présentent les résultats expérimentaux obtenus en appliquant ces deux approches et la méthodologie décrite dans ce chapitre.