gène bla
CTX-M-11- Extraction d’ADN
Après décongélation des prélèvements de matières fécales et/ou de lisier, l’extraction d’ADN a été réalisée en deux étapes. La première étape consiste à extraire l’ADN grâce à une extraction mécanique couplée à une extraction chimique. La deuxième étape consiste à purifier l’ADN grâce à un robot (M48, Qiagen) utilisant la technologie des billes magnétiques (Yu & Morrison 2004).
Dans un premier temps, 400 mg de billes de verre (de 0,25 à 0,5 mm) (VWR) et 1 ml de solution de lyse (500mM NaCl, 50mM Tris-HCl à pH 8, 50 mM EDTA, 4% de SDS et de l’eau) ont été ajoutés à 250 mg de matières fécales ou de lisier. Une lyse mécanique a été effectuée pendant 3 minutes à une fréquence de 30 Hz (Tissue Lyser, Qiagen). Les échantillons ont été ensuite incubés 15 minutes sous agitation à 70°C.
A la suite de cette incubation, les échantillons ont été centrifugés à 4°C pendant 5 minutes à 16000 g et le surnageant a été récupéré dans des tubes préalablement déposés dans la glace. L’étape précédemment décrite a été répétée à l’exception du volume de tampon de lyse introduit, 300 µl de tampon de lyse ont été déposés dans les échantillons au lieu du 1 ml. Une fois la totalité du surnageant récupérée, une tablette permettant l’adsorption des inhibiteurs a été introduite (tablette Inhibitex, Qiagen, Courtaboeuf, France). Après 1 minute d’incubation, les échantillons ont été vortexés pendant 1 minute. A la suite d’une centrifugation à 4°C pendant 3 minutes à 16000 g, le surnageant a été récupéré.
Une seconde lyse chimique a été réalisée grâce à l’ajout de 15 µl de protéinase K (20mg/ml) (Qiagen, Courtaboeuf, France). Cette enzyme a été activée à 56°C pendant 30 minutes. Enfin, 200 µl des échantillons ont été prélevés et déposés dans des tubes adaptés au robot d’extraction. La purification de l’ADN a été réalisée grâce à un kit (Kit Mag Attract M48, Qiagen, Courtaboeuf, France) adapté au robot d’extraction M48 (Qiagen). L’ADN purifié a été ensuite dosé au Nanodrop (Thermoscientific). Les échantillons d’ADN issus des prélèvements de fécès ont été ajustés à 10 ng d’ADN/µl. Par contre, compte tenue de la faible concentration en ADN, les échantillons de lisier n’ont pas été ajustés à 10 ng d’ADN/µl. Les ADN ont été stockés à +4°C avant d’être testés en PCR quantitative.
2- Quantification des E. coli totaux, de la souche E. coli ED1a et de la souche E. coli Nissle
2-1 Construction des gammes étalon avec de l’ADN purifié
Chaque souche a été cultivée sur gélose MH (Biorad). Après 24h d’incubation à 37°C ± 2°C, un lysat d’ADN a été réalisé sur la souche comme décrit dans le paragraphe IV-2 (page 41). L’ADN a ensuite été purifié sur colonne de silice Qiagen (QiaAmp DNA kit) (Qiagen, Courtaboeuf, France).
Puis la solution d’ADN a été dosée au spectrophotomètre (Nanodrop). Une lecture a été faite à 260 nm afin de doser l’ADN et une lecture a été faite à 280 nm afin de doser les protéines résiduelles (le rapport DO 260 nm/DO 280 nm doit être compris entre 1,8 et 2). L’ADN a été ensuite aliquoté et conservé à -20°C. Lors de chaque PCR, un tube d’ADN a été décongelé et des dilutions de 10 en 10 jusqu’à la dilution 10-7
ont été réalisées. 2-2 Les amorces et les sondes des PCR quantitative
Les amorces et les sondes utilisées pour la quantification des E. coli totaux, de la souche E.
coli ED1a et la souche E. coli Nissle ont été décrites dans l’annexe 2.
2-3 Protocole des PCR quantitative
Chacun des mélanges réactionnels a été réalisé dans les conditions précédemment décrites dans l’annexe 4, à l’exception de l’ajout d’un contrôle interne (1X du mix IPC et 0,25 X ADN IPC) (Applied Biosystem, Illkirch, France) permettant la validation des résultats.
3- Quantification du gène blaCTX-M-1
3-1 Clonage du gène blaCTX-M-1
Le clonage de ce gène a été réalisé dans le but de connaitre exactement la quantité de plasmide dans la gamme. Dans un premier temps, des amorces permettant l’amplification du gène cible ont été déterminées. Pour cela, les séquences nucléotidiques du gène d’intérêt ont été téléchargées à partir de la base de données GenBank (http://www.ncbi.nih.gov/) à partir de la référence Genbank n° X92506.1. Ces séquences ont été ensuite alignées via le programme Multalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/) afin de créer pour chaque gène une séquence consensus qui a permis la conception des amorces. Les amorces ont été définies avec le programme Primer 3 (http://primer3.ut.ee/) de manière à encadrer la plus longue partie de l’ORF des gènes cibles.
Enfin, la spécificité des amorces a été vérifiée par l’outil d’alignement BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov/blast/) ainsi qu’avec le programme de PCR en ligne InSilico
Tableau 17: Séquences nucléotidiques des amorces utilisées pour le clonage du gène blaCTX-M-1
Nom des séquences Séquences nucléotidiques
CTX_M1_for 5’ ACTGGCGCCTCCCATGGTTAAA 3’
CTX_M1_rev 5’TCACATATGGCTATTACAAACCGTT 3’
Dans un second temps, l’amplification du gène d’intérêt a été réalisée par PCR à partir de la souche E. coli M63. Les réactions ont été effectuées dans un volume final de 50 µl contenant 1 µl de dNTP à 10 nM, 2µl d’amorces à 10 µM, 1.5 µl de MgCl2 à 50 mM, 5µl de tampon 10X, 0.2 µl de Taq Platinium à 5U/µl (Invitrogen, Illkirch, France), 35,2 µl d’eau DNase free (Eurobio) et 5 µl d’ADN. La taille de l’amplicon a été vérifiée grâce à une migration sur gel d’agarose à 2%.
Dans un troisième temps, le clonage du produit PCR dans le vecteur TOPO TA a été réalisé avec le kit TOPO TA cloning kit (Invitrogen). Pour cela, 4 µl du produit PCR ont été ajoutés à 2 µl de la solution S1 (pour une réaction : 1µl de solution saline + 1µl de vecteur PCR4-TOPO (figure XV)). Cette suspension a été mélangée doucement, incubée 5 minutes à température ambiante et ensuite placée dans la glace. 2µl de bactéries TOP10 chimio-compétentes ont été ajoutés. Ce mélange a été incubé 5 à 10 minutes dans la glace. Après un choc thermique à 42°C pendant 30 secondes un transfert rapide dans la glace a été effectué. Une incubation d’une heure à 37°C a été réalisée après ajout du milieu SOC, un milieu optimal de croissance additionné de glucose et qui permet d’augmenter l’efficacité de la transformation. Finalement 50 µl du mélange ont été étalés sur milieu Mueller Hinton (Biorad) avec 50 mg/l d’ampicilline (Sigma Aldrich). Ces boites ont été incubées pendant 24 heures à température de 37°C ± 2°C. A la fin de l’incubation, 5 clones ont été repris et repiqués dans 5 ml de bouillon MH (Biorad). Ces suspensions ont été incubées 24 heures à 37°C± 2°C.
Figure XV: Caractéristiques du vecteur PCR4-TOPO et de la séquence entourant le site de
clonage
Après 24 heures d’incubation, une extraction plasmidique des cinq clones a été réalisée grâce au kit Nucleospin plasmid (Macherey-Nagel, Hoerdt, France). Dans un premier temps, les suspensions bactériennes ont été centrifugées 30 secondes à 11000g. Le culot a été ensuite suspendu avec 250 µl de tampon A1 (Macheray-Nagel).
250 µl du tampon A2 (Macheray-Nagel, Hoerdt, France) ont été ajoutés et le mélange a été incubé à température ambiante pendant 5 minutes. Une centrifugation a été effectuée pendant 5 minutes à 11000g après l’ajout de 300 µl de tampon A3 (Macheray-Nagel) (mélange par retournement). Un volume maximal de 750 µl a été déposé sur la colonne qui a été au préalable placée dans un tube de 2ml. Une centrifugation de 5 minutes à 11000g a été effectuée dans le but d’éliminer le filtrat. Ces deux dernières étapes peuvent être répétées si le volume de surnageant est supérieur à 750 µl. Un volume de 600 µl de tampon A4 (Macheray-Nagel) a été ajouté sur la colonne. Deux centrifugations ont été effectuées, la première a été réalisée pendant 1 minute à 11000g dans le but d’éliminer le filtrat. La deuxième a été effectuée à la même vitesse pendant 2 minutes permettant ainsi l’asséchement de la colonne. L’élution a été réalisée avec l’ajout de 50 µl du tampon AE (Macheray-Nagel).
Afin de vérifier la présence la présence du blaCTX-M-1, les plasmides purifiés ont été séquencés. Les séquences obtenues ont vérifiées par l’outil d’alignement BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).
3-2 Construction des gammes étalon avec le plasmide contenant le gène bla
CTX-M-1
La concentration en ADN plasmidique a été mesurée par le fluoromètre Qubit® (Invitrogen). Le nombre de copies de plasmides portant le gène d’intérêt a été déterminé grâce à la formule suivante : Nombre de copies/µl = C x 10 -6 x Na 2 x MM (dNTP) x Taille C: µg/µl Taille du plasmide en pb Na = 6,02.1023 MM (dNTP) = 330 Da Des gammes de 1 à 1.109 copies/µl ont été préparées et stockées à -20°C
Les amorces et les sondes de la PCR quantitative
Les amorces et les sondes utilisées pour la quantification de ce gène ont été décrites dans l’annexe 2.
Protocole de la PCR quantitative ciblant le gène blaCTX-M-1
Le mélange réactionnel a été préparé dans les conditions décrites dans l’annexe 4. Le contrôle interne (1X du mix IPC et 0,25 X ADN IPC) (Applied Biosystem) n’a pas été ajouté, compte tenu du faible nombre (25cycles) de cette PCR qui ne permet pas l’amplification du contrôle interne.