Purification des protéines

Diverses techniques sont utilisées pour purifier les protéines d’intérêt et dans la majorité des cas la purification est effectuée en deux étapes. La chromatographie d’échange de cations (CEC) ou d’affinité sur colonne (NAC). Entre les deux étapes de purification, un aliquot de chaque fraction est prélevé pour doser les protéines. Le reste est dialysé par le tampon adéquat

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ou dessalé sur colonne Econo-Pac 10DG (BIO-RAD), puis concentré par lyophilisation pendant 24 h.

2.2.5.1 Purification par le système FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)

Un appareil de chromatographie automatisé (AKTA, GE Healthcare) réfrigéré à 4°C est utilisé. Il contient deux pompes permettant l’injection de tampon A (tampon d’équilibration et de lavage) et de tampon B (tampon d’élution).

Chromatographie d’échange de cations

La chromatographie d’échange de cations est effectuée sur une colonne SP-sepharose, HiTrap (GE Healthcare, 1 mL) mise en œuvre sur l’automate de chromatographie FPLC. La colonne est activée préalablement par 5 mL de tampon d’élution B (50 mM MES, 1,6 M NaCl, pH 5,6) à 1 mL/min, puis équilibrée par 10 mL de tampon de charge (A) (50 mM MES, pH 5,6 ajusté avec KOH) à 1 mL/min. Entre 1 et 2 mg de protéines lyophilisées sont solubilisées dans 10 mL de tampon de charge. Elles sont ensuite déposées à un débit de 0,5 mL/min sur cette colonne et l’effluent est récupéré (10 mL). Après une étape d’élution par un gradient continu de 0 à 50% de tampon d’élution, à 1 mL/min pendant 24 min, un palier à 50% de tampon d’élution est réalisé pendant 3 min à 1 mL/min suivi de deux autres, l’un à 75% et l’autre à 100% de tampon B réalisés pendant 3 min chacun à 1 mL/min. Les fractions d’élution sont collectées puis rassemblées par 3. Un aliquot de chaque mélange de fractions est prélevé pour le dosage des protéines. Le reste est dessalé sur colonne Econo-Pac 10DG (BIO-RAD), puis lyophilisé pendant 24 h.

Purification des protéines sur colonne HisTrap

La chromatographie d’affinité vis-à-vis des résidus His est effectuée sur une colonne

HisTrap FF crude (GE Healthcare, 1 mL).

Purification de PAC/V5/6xHis à partir de la fraction bactérienne soluble

La première étape de la purification est l’équilibration de la colonne par le tampon A (50 mM NaNa2PO4 pH 7,4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole, 1 mM DTT). Vingt mg de

l’extrait protéique bactérien soluble dilué 3x dans le tampon A sont fixés sur la colonne (débit : 0,5 mL/min). Des lavages (10 vol de colonne) sont effectués avec du tampon A à 10 mM d’imidazole pour éliminer les protéines non fixées. Suite aux lavages, plusieurs conditions d’élution de 10% à 100% de tampon B (tampon A additionné de 300 mM d’imidazole), par palier ou par gradient en conditions non dénaturantes, ont été testées.

Purification de PAC/V5/6xHis à partir de la fraction bactérienne insoluble

La première étape de la purification est l’équilibration de la colonne par le tampon A constitué de tampon de lyse (50 mM Na2HPO4-NaH2PO4 pH 8, 500 mM NaCl, 10 mM

Imidazole, 1 mM DTT) additionné de 8 M d’urée. Douze mg de l’extrait protéique de la fraction insoluble dilué 3X dans le tampon A est fixé sur la colonne (débit : 0,5 mL/min). Des lavages (10 vol de colonne) sont ensuite effectués avec du tampon A à 10 mM imidazole pour éliminer les protéines non fixées. Suite aux lavages, un gradient linéaire de tampon A contenant 8 M à 0 M d’urée est effectué en 30 min pour la renaturation des protéines. L’élution des protéines est effectué par gradient de 0% à 100% de tampon B (tampon A additionné de 500 mM imidazole et sans urée) en 15 min.

Purification de MBP/PAC/V5/6xHis à partir de la fraction bactérienne soluble

La première étape de la purification est l’équilibration de la colonne dans le tampon A (10 mM Na2HPO4-NaH2PO4 pH 7,4, 500 mM NaCl). Trente cinq mg de l’extrait protéique

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dilué 10X dans le tampon A à 20 mM imidazole sont fixés sur la colonne (débit : 0,5 mL/min). Des lavages (10 vol de colonne) sont effectués avec du tampon A à 20 mM

imidazole. Suite aux lavages, plusieurs conditions d’élution de 0% à 100% de tampon B (10 mM Na2HPO4-NaH2PO4 pH 7,4, 500 mM NaCl, 300 mM d’imidazole), par palier ou par

gradient en conditions non dénaturantes sont testées. En conditions dénaturantes, l’extrait protéique soluble dilué 10X dans du tampon A additionné de 8 M d’urée est déposé sur la colonne préalablement équilibrée par le tampon A. Ensuite, un gradient linéaire de tampon A contenant de 8 M à 0 M d’urée est effectué pour la renaturation des protéines en 30 min. L’élution des protéines est effectué par 3 paliers, à 10%, 50% et 100% de tampon B (10 mM Na2HPO4-NaH2PO4 pH 7,4, 500 mM NaCl, 300 mM d’imidazole).

Clivage du tag MBP par le facteur Xa

Pour la coupure du tag MBP, l’échantillon purifié est dessalé, lyophilisé et repris par le facteur Xa (New England Biolabs) à 200 µg/mL (20 µg de facteur Xa par mg de protéine de fusion) dans du tampon protéase (20 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2) et

incubé à température ambiante. Une cinétique est faite en prélevant des échantillons à 5 h et 20 h, suivie d’une analyse par SDS-PAGE pour visualiser le clivage.

Des essais de clivage ont aussi été tentés sur colonne HisTrap lors de la purification des protéines dans les conditions dénaturantes. Après fixation des protéines sur la colonne

HisTrap et leur renaturation, la colonne est enlevée du dispositif FPLC et lavée à l’aide de 10

vol de tampon protéase et incubée ensuite 24 h par de la protéase à 200 µg/mL à température ambiante. Après incubation, la colonne est lavée 10X par le tampon protéase et éluée comme précédemment décrit.

2.2.5.2 Chromatographie d’affinité sur colonne Ni-NTA

Le kit Ni-NTA fast start (QIAGEN) est utilisé. Les fractions lyophilisées issues de la purification par chromatographie d’échange de cation d’intérêt sont solubilisées dans du tampon 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8, puis passées par gravité

sur une colonne Ni-NTA de 0,5 mL. L’effluent est récupéré et rechargé sur le support. Cette opération est renouvelée 3 fois. La colonne est ensuite lavée par 2 fois 4 mL de tampon 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole pH 8. Enfin l’élution est réalisée par

3,1 mL de tampon 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8.

2.2.5.3 Chromatographie d’affinité sur colonne de lectine

Une chromatographie d’affinité sur colonne de lectine est réalisée. La lectine utilisée est PNA (Peanut Agglutinin d’Arachis hypogaea) spécifique du Gal et GalNAC greffée sur un support d’agarose. Un volume de 1 mL de suspension contenant 0,5 mL de résine est prélavé avec 5 mL (10 vol) de tampon de prélavage (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 3,33 mM MgCl2 /MnCl2/CaCl2). La matrice est ensuite équilibrée avec 5 mL de tampon d’équilibration

(20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1 mM MgCl2 /MnCl2/CaCl2). Après chaque étape

(prélavage, équilibration), la matrice est laissée décanter, puis le surnageant est prélevé. Environ 1 mg de protéines pariétales dessalées et lyophilisées est repris dans l mL du tampon d’équilibration et mis en contact avec la matrice pendant une nuit à 4°C. L’effluent est ensuite récupéré. Après un lavage avec 3 mL de tampon d’équilibration, les protéines fixées sont éluées avec 1,5 mL de tampon d’équilibration additionné de 1 M de galactose.

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2.2.6 Tests d’interactions protéines/polysaccharides