PTP1B inhibe l’action de l’EGF

PTP1B joue un rôle dans la régulation négative de la signalisation induite par l'EGF et aide à supprimer l'entrée du cycle cellulaire.

L’expression importante de PTP1B dans les CE de donneurs âgés suggère que la baisse de l’activité proliférative en réponse à l’EGF est due, au moins en partie, à l’augmentation de l’activité de PTP1B.

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III.3.2.2. PTP1B inhibe l’action de l’EGF

L’EGF induit une prolifération des CE cornéennes chez le lapin [517], les bovins [395, 518], le chat [470, 519], les primates non humains [520, 521] et les hommes [420, 422, 461, 520] mais le niveau relatif de synthèse d’ADN et le nombre de CE qui se divisent en réponse au stimulus est relativement faible, en particulier pour les CE provenant de donneurs humains âgés [422]. Bien que l’EGF soit connu pour stimuler la prolifération de ces CE il y a encore peu d’information concernant les mécanismes de régulation du signal.

Le récepteur à l’EGF (EGFR) est une protéine transmembranaire (1186 acides aminés) qui fait parti du groupe des récepteurs possédant une activité tyrosine kinase intrinsèque [522]. La phosphorylation réversible de la tyrosine aide à la régulation de nombreux mécanismes cellulaires tels que la prolifération, la migration et la différenciation [523]. En réponse à la liaison d’un ligand, les résidus spécifiques tyrosine Tyr992 et Tyr1148 situés dans le domaine intracellulaire COOH-terminal de l’EGFR deviennent autophosphorylés. [524]. L’autophosphorylation de la tyrosine dans les récepteurs favorise la fixation directe de protéines de signalisation contenant des domaines de l'homologie 2 de Src (SH2) [524-527]. La liaison du ligand à l'EGFR peut induire l'activation d'un certain nombre de voies de signalisation comprenant la phospholipase C-γ (PLC-γ), les cascades de la protéine kinase C (PKC) et ras conduisant à l’activation de MAP kinases différentes. Dès son activation par la fixation du ligand, l’EGFR est rapidement internalisé dans des endosomes, le domaine extracellulaire du récepteur se retrouvant dans les endosomes et son domaine intracellulaire s’étendant vers le cytoplasme. L’EGFR est encore actif dans l’endosome pendant plusieurs minutes avant soit d’être dégradé par les lysosomes soit d’être recyclé vers la membrane plasmique [528]. Le sort du récepteur ainsi que la sortie du processus de signalisation dépend d’une part de la poursuite de la fixation du ligand et d’autre part de son activité kinase intrinsèque [522, 529].

L’activité catalytique de nombreux récepteurs tyrosine kinases est fortement régulée par des protéines tyrosine phosphatases (PTPs), qui agissent comme des interrupteurs « on/off » des voies de signalisation [523, 530]. PTP1B contribue à la régulation de plusieurs

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fonctions cellulaires notamment la prolifération. Cette protéine se lie à l’EGFR in vitro [524] et in vivo [531], interagit et déphosphoryle spécifiquement les résidus Tyr992 et Tyr1148 situés sur le domaine cytoplasmique du récepteur [524]. Des études indiquent qu’il existe une compétition pour la fixation de PTP1B sur ces sites. Le domaine SH2 ainsi que la PLC-γ interagissent avec Tyr992 alors que la protéine activatrice de la GTPase Ras (GAP) interagit avec Tyr1148. Cette compétition de liaison démontre que PTP1B doit jouer un rôle dans la régulation du signal descendant de l’EGFR via la PLC-γ et/ou GAP.

L’équipe de Joyce a montré l’expression de différents types de PTPs (PTP1B, SHP-1, SHP-2, PTP-mu et PTEN) dans les CE cornéennes de rat ex vivo et in vitro [532]. Lorsque des CE en culture, sans SVF, sont traitées avec un inhibiteur de phosphatase, le sodium

orthovadate (SOV), le nombre de CE entrant en prolifération (Ki67+) augmente, suggérant que les PTPs interviennent dans l’inhibition de la régulation du cycle cellulaire des CE cornéennes.

La même équipe a démontré l’implication de PTP1B dans l’inhibition de la prolifération des CE cornéennes de rat in vitro [533]. L’expression des transcrits de PTP1B est similaire dans les CE confluentes et subconfluentes mais est 3 fois supérieure dans les CE non confluentes. En immunomarquage, PTP1B est localisée dans des structures vésiculaires situées sous les membranes plasmiques. Les récepteurs à l’EGF sont localisés au niveau des bordures intercellulaires mais 15 minutes après traitement à l’EGF ils se retrouvent majoritairement au niveau cytoplasmique. Le pic de phosphorylation de la Tyr992 de l’EGFR a lieu 5 minutes après la stimulation des CE avec de l’EGF et redescend rapidement à son niveau basal en 30 minutes. Dans des CE prétraitées avec un inhibiteur de l’activité de PTP1B (CinnGEL 2Me), le pic de phosphorylation de Tyr992 se produit 2 minutes après l’ajout d’EGF et reste à un niveau élevé 60 minutes après le traitement. Dix huit heures après l’ajout d’EGF, les cultures prétraitées au CinnGEL 2Me montre une augmentation de 1,7 fois du

nombre de CE Ki67+ comparé aux cultures contrôles. La comparaison des niveaux en ARNm

et en protéines de PTP1B indique que PTP1B subit une régulation post-traductionnelle. La

localisation de PTP1B dans des vésicules sous la membrane plasmique et l’internalisation de EGFR après stimulation par l’EGF suggèrent qu’il existe une interaction entre les deux protéines et que PTP1B régule l’activité du récepteur en agissant sur Tyr992. PTP1B joue un

rôle dans la régulation négative de la signalisation induite par l'EGF et aide à supprimer l'entrée dans le cycle cellulaire.

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La même équipe a étudié le rôle de PTP1B dans la régulation de l’entrée en prolifération des CE humaines, ex vivo et in vitro, en réponse à une stimulation avec de l’EGF chez des donneurs jeunes (<30 ans ; n=8 ; âge moyen : 9,1±8,5 ans ; 0-18 ans) et âgés (>50 ans ; n=10 ; âge moyen : 66,3±7,5 ans ; 55-78 ans) [534]. Des immunomarquages ont permis de localiser PTP1B dans le cytoplasme des CE en culture et sur cornée ex vivo montées à plat (Figure 39).

Figure 39 : Localisation de PTP1B dans des CE cornénnes humaines ex vivo et in vitro.

(A) Representative image of PTP1B (green) staining in the endothelium of a cornea obtained from a 59-year-old donor. PTP1B is localized in a punctate pattern mainly within the cytoplasm. Some punctate staining is also visible in nuclei (red). (B) PTP1B staining in subconfluent cells cultured from a 55-year-old donor results in a similar punctate pattern in the cytoplasm and nucleus. Image is an overlay from both the FITC and rhodamine channels. green: PTP1B. red: Propidium iodide.Original magnification: 40X.

(D’après Ishino et al., 2008 [534])

La présence de EGFR et de PTP1B dans les CE a été confirmée par Western Blot.

Aucune différence significative n’était observée dans l’expression du récepteur à l’EGF en fonction de l’âge alors que l’expression de PTP1B était significativement supérieure dans les CE de donneurs âgés. Une pré-incubation des CE avec l’inhibiteur du PTP (CinnGEL 2Me) induisait une augmentation significative du nombre de CE incorporant le BrdU 48 heures

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Figure 40 : Effet de l'inhibiteur à PTP1B sur l'entrée du cycle cellulaire des CE en réponse à une stimulation à l’EGF.

Subconfluent cells were pre-incubated for 1 h in medium containing either DMSO alone or 25 µM of the PTP1B inhibitor, CinnGEL 2Me, diluted in DMSO. Following this pre-incubation step, 25 ng/ml EGF was added to all cultures. Samples were taken for BrdU staining at 0, 12, 24, or 48 h after EGF addition.

Bar graph shows the average percent of BrdU-positive HCEC at each time point. Bars represent SEM. The asterisk indicates statistical significance at p=0.019.

(D’après Ishino et al., 2008 [534])

Les immunomarquages précisent que PTP1B est localisé dans le réticulum endoplasmique, site connu d’interaction EGFR/PTP1B après stimulation par l’EGF.

L’expression importante de PTP1B mais pas de l’EGFR dans les CE de donneurs âgés suggère que la baisse de l’activité proliférative en réponse à l’EGF est due, au moins en partie, à l’augmentation de l’activité de PTP1B. Le fait que l’inhibition de PTP1B

augmente le nombre relatif de CE entrant en phase S du cycle indique que PTP1B est un régulateur négatif de la prolifération cellulaire induit par l’EGF. Il pourrait être possible d’augmenter les capacités prolifératives des CE cornéennes, notamment chez les personnes âgés, en inhibant l’activité de cette importante protéine tyrosine phosphatase.

La Figure 41 schématise l’action de PTP1B sur la régulation du cycle cellulaire des CE cornéennes après stimulation avec de l’EGF.

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Figure 41 : Action de PTP1B sur la régulation du cycle cellulaire des cellules endothéliales cornéennes après stimulation avec du FGF-2.

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