Les mêmes échantillons que ceux utilisés dans la puce de méthylation ont été sélectionnés avec un contrôle qualité par spectrophotométrie UV (Nanodrop SD-1000). Le rapport d’absorbance A260/A280 détermine la pureté de notre extraction car il rapporte la concentration détectée à 260 nm (zone d’absorbance des acides nucléiques) à la concentration
2 dans le cas d’une solution d’ADN purifiée. Si celui-ci est inférieur à 1,8, l’échantillon est probablement contaminé par des protéines. Si celui-ci est supérieur à 2, il est probablement contaminé par des ARN. Dans notre cas, la totalité de nos échantillons avaient un rapport satisfaisant : ( 𝐷𝑂260
𝐷𝑂280= 1.85 ± 0.03).
Le bisulfite est un produit chimique contenant l’anion bisulfite (HSO3- ou hydrogénosulfite). Ce composé est utilisé pour transformer les cytosines non méthylées en uracile au niveau de l’ADN (figure extraite de Tollefsbol T. 2011(209)).
Les cytosines méthylées ne sont pas converties en uracile et restent des cytosines après traitement au bisulfite. Ainsi, le traitement au bisulfite va permettre d’étudier la méthylation de l’ADN par séquençage : si le résultat du séquençage est une cytosine, alors la cytosine initiale était méthylée ; en revanche, si la cytosine initiale était non méthylée, le résultat du séquençage sera une thymine (car les uraciles seront transformées en thymine lors d’une PCR intermédiaire).
Le traitement au bisulfite des ADN dure environ 6 heures avec une succession de phases de dénaturation permettent de séparer et de bisulfiter les deux brins d’ADN. La qualité du traitement par bisulfite est contrôlée par réalisation d’une Polymérase Chain Reaction (PCR)
en utilisant un gène témoin (MAEL) et des amorces dessinées pour amplifier uniquement la séquence de ce gène après traitement au bisulfite (amorces bisulfite-spécifiques) suivie d’une migration électrophorétique sur gel d’agarose. Nos amorces bisulfite-spécifiques ont permis d’amplifier le gène MAEL dans les échantillons traités au bisulfite ce qui permet de s’assurer que notre traitement au bisulfite a été efficace.
Pour les études de méthylation on distingue les PCR méthylation spécifiques et les PCR non méthylation spécifiques. Dans les PCR méthylation spécifiques, les amorces sont dessinées pour permettre uniquement l’amplification des brins contenant une cytosine après traitement au bisulfite. Dans les PCR non méthylation spécifiques, les amorces ne comportent pas de nucléotides ambigus donc ne recouvrent pas les CpG dont la méthylation peut varier. Dans notre étude des PCR non méthylation spécifiques ont été réalisées pour amplifier la séquences contenant les CpG d’intérêt à confirmer. Les amorces-test (amorces sans modification terminale) ont été dessinées à l’aide du logiciel MethPrimer. Une fois les amorces et les conditions de PCR mises au point pour chaque gène, des amplifications ont été réalisées avec une amorce reverse biotinylée en 5’. L’amorce forward utilisée est restée identique aux PCR précédentes. Les PCR avec amorces biotinylées permettent l’amplification de la région d’intérêt et de synthétiser des amplicons dont un brin se termine par la biotine. Ce brin va être récupéré à l’aide de billes de streptavidine qui fixent la biotine. La biotine est une vitamine hydrosoluble qui se lie à la streptavidine (protéine bactérienne), par une liaison de haute affinité et de grande spécificité. Les produits post-PCR sont mélangés avec les billes de streptavidine et mis à agiter pendant 10 minutes à température ambiante.
Ensuite, le brin d’ADN amplifié accroché par la biotine aux billes de streptavidine est récupéré puis déposé sur une plaque contenant une solution d’hybridation et une amorce de séquençage. La plaque est ensuite placée dans la machine de pyroséquençage (PyroMark Q24 - Qiagen®). Cette machine comporte un capteur de lumière et un emplacement pour disposer les réactifs qui seront ajoutés séquentiellement : enzymes, substrat et chacun des dNTP.
Les désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP) sont ajoutés les uns à la suite des autres selon une séquence programmable. Si le dNTP ajouté correspond au dNTP attendu, celui-ci est incorporé dans le brin en cours de synthèse et un pyrophosphate inorganique (PPi) est libéré.
Ce PPi va permettre à la sulfurylase de fabriquer de l’ATP qui sera utilisé par la luciférase pour émettre un signal lumineux proportionnel à la quantité d’ATP (voir la figure ci-dessous extraite de la thèse de Y. Loe-Mie (160)). La dégradation des nucléotides non incorporés est effectuée à chaque étape par l’apyrase.
PROTOCOLE
A) Traitement des ADN au bisulfite : (cf EpiTect Plus Bisulfite Conversion Handbook by Qiagen)
1) décongeler les ADN
2) dissoudre chaque aliquot de Bisulfite Mix dans 800L d’eau RNase free (1 aliquot pour 8 réactions) et vortexer jusqu’à dissolution complète
3) préparer les réactions dans des tubes de PCR en mélangeant, dans cet ordre : H20
1 g ADN ….. L x [ ] Bisulfite Mix 85 L DNA protect buffer 35L
4) vortexer les produits (changement de couleur vert -> bleu) 5) placer les tubes dans le thermocycleur
Dénaturation 5 min 95°C Incubation 25 min 60°C Dénaturation 5 min 95°C Incubation 85 min 60°C Dénaturation 5 min 95°C Incubation 175 min 60°C Maintien 20°C
6) Centrifuger les tubes puis transférer l’ensemble du contenu dans un tube de 1.5 mL
7) Ajouter 310 L de Buffer BL (ajouter du Carrier RNA si quantité d’ADN < 100ng) puis vortexer et centrifuger
8) Ajouter 250 L d’éthanol 100% puis vortexer 15 s et centrifuger 9) Transférer l’ensemble du contenu d’un tube dans 1 spin colonne 10) Centrifuger la spin colonne à la vitesse maximale pendant 1 min 11) Eliminer le filtrat
12) Ajouter 500 L de Buffer BW
16) Incuber 15 min à température ambiante
17) Centrifuger à la vitesse maximale pendant 1 min 18) Eliminer le filtrat
19) Ajouter 500 L de Buffer BW, centrifuger à la vitesse maximale pendant 1 min et éliminer le filtrat 20) Répéter l’étape 19
21) Ajouter 250 L d’éthanol, centrifuger à la vitesse maximale pendant 1 min et éliminer le filtrat 22) Placer la colonne dans un tube de 2 mL et centrifuger à la vitesse maximale pendant 1 min 23) Placer la colonne dans un tube de 1.5 mL et ajouter le Buffer EB (15 L à adapter selon la concentration finale voulue, en restant >10 L)
24) Incuber la colonne 1 min à température ambiante
25) Centrifuger 1 min à 15 000 g (12 000 rpm) et récupérer l’ADN dans le nouveau tube. 26) Doser l’ADN au spectrophotomètre
B) PCR contrôle : (cf Platinum Taq DNA Polymerase)
27) Préparer les réactifs pour les PCR contrôles PCR Buffer (sans Mg) 10X 2.5 L
MgCl2 50 mM 0.75 L
dNTP mix 10 mM 0.5 L
(chaque dNTP doit avoir une concentration finale de 0.2mM) primer forward 10 M 0.5 L
primer reverse 10 M 0.5 L
ADN 50 ng
Taq 0.1 L
H20 to 25 L
Les primers du gène MAEL servent de contrôle positif pour vérifier le traitement au bisulfite.
Les PCR contrôles sont réalisées sur de l’eau (témoin négatif), de l’ADN non bisulfité et le même échantillon d’ADN bisulfité
28) Cycle PCR Dénaturation 5 min 95°C Dénaturation 30 sec 95°C
Hybridation 30 sec 57°C
(température dépendante du couple de primers)
Elongation 30 sec 72°C
Fin des cycles 10 sec 72°C
Maintien 4°C
29) Préparer un gel d’agarose 2% (4g d’agarose dans 200 mL de TBE) et ajouter 20 L de BET
Attention le BET est un composé hautement cancérigène : à manipuler avec précaution et des gants, jeter les objets contaminés dans la poubelle dédiée.
30) Charger 5 L du produit PCR et 3 L de bleu de méthylène dans les puits du gel 31) Faire migrer 30 min à 100 V dans une cuve d’éléctrophorèse remplie de TBE 32) Sortir le gel de la cuve et le déposer sur la plaque du Chemidoc
33) Allumer la lumière de la caméra, régler le curseur sur « UV/White » 34) Ouvrir le logiciel Quanti
34) Prendre une image du gel en mode EpiWhite pour vérifier son positionnement et régler le focus 35) Prendre une image du gel en mode TransUV pour faire apparaître l’ADN marqué par le BET Une seule bande doit apparaitre, correspondant à la séquence d’ADN amplifiée, uniquement pour les échantillons bisulfités
C) PCR pour le test des amorces :
Des PCR dans les mêmes conditions qu’à l’étape 27 et 28 sont réalisées avec des primers correspondant au gène d’intérêt. La température d’hybridation est à ajuster en fonction du couple de primer choisi.
Pour les amorces de CHL1 : température d’hybridation optimale = 55°C
L’efficacité de la PCR est vérifiée par électrophorèse sur gel en suivant les étapes 29 à 35.
D) PCR avec amorces biotinylées :
L’amorce reverse doit être biotinylée à l’extrémité 5’. Les PCR sont réalisées selon le même protocole et dans les mêmes conditions que pour le test des amorces.
E) Récupération du brin biotinylé par les billes de streptavidine:
36) Mélanger la solution contenant les billes de streptavidine par retournement (éviter toute sédimentation).
37) Dans chaque tube contenant les produits post-PCR biotinylés, rajouter xxx de buffer xxx et xxx de la solution contenant les billes de streptavidine.
38) Mettre les tubes à agiter à température ambiante pendant 10 min à 1 400 rpm 39) Préparer les différents bains dans les bacs du xxx
40) Brancher l’aspiration et mettre l’appareil manuel sur On
41) Aspirer le contenu de l’ensemble du tube post PCR avec l’appareil manuel 42) Placer l’appareil manuel dans le 1er bain contenant l’éthanol 70% pendant 30s 43) Placer l’appareil manuel dans le 2e bain contenant le Denaturation Buffer pendant 30s 44) Placer l’appareil manuel dans le 3e bain contenant le Wash Buffer pendant 30s
45) Laisser sécher l’appareil manuel à la verticale pendant quelques secondes
46) placer l’appareil manuel au dessus des puits d’une nouvelle plaque transparente cont
47) Appuyer sur Off et secouer légèrement l’appareil manuel dans la solution pour faire tomber les brins d’ADN contenant la biotine
48) Rincer l’appareil manuel dans 2 bains contenant de l’eau
49) Placer la plaque transparente dans un bain à sec à 80°C pendant 2 min puis laisser refroidir pendant 5 min minimum
F) Pyroséquençage avec le PyroMark Q24 :
50) créer le programme de pyroséquençage à partir du logiciel en entrant la séquence à étudier, la CpG d’intérêt et la séquence du primer de séquençage
Tools > new Assay > entrer la séquence à étudier et la CpG d’intérêt > Save As « X »
Tools > new Run > Glisser « X » sur chaque position du run > sélectionner méthode 0012 > Save As 51) récupérer le programme créé sur clef USB
52) préparer la cartouche contenant les enzymes, le substrat et les dNTP selon les instructions du programme et l’introduire dans le PyroMark
53) introduire la plaque transparente dans le PyroMark 54) fermer le PyroMark et introduire la clef dans le port USB 55) sélectionner Run puis le programme désiré
56) le séquençage démarre et dure environ 1h
57) récupérer les données sur la clef USB et les transférer dans le logiciel ; cliquer sur Full Report et récupérer le rapport pdf