Protocole de préparation des bactéries

=²λ^{lC (3.1)}

AvecAl’absorbance (ou densité optique) à la longueur d’ondeλ,I₀l’intensité de la lumière incidente, I l’intensité de la lumière sortante,²le coefficient d’extinction molaire,lla longueur du trajet optique etCla concentration molaire de la solution.

Bien que cette technique soit empirique, elle permet d’avoir une bonne estimation de la population en ayant préalablement établi une courbe d’étalonnage donnant la concentration en bactéries en fonction de la densité optique. Pour cela, nous avons utilisé une technique de dénombrement sur milieu gélosé. Nous avons réalisé une culture d’E. Coli, nous avons ensuite réalisé un gradient de dilution logarithmique afin d’avoir plusieurs échantillons à des concentrations différentes. Autant de boites de Pétri que d’échantillons ont été ensemencées puis mis en incubation pendant 24h. En partant du principe que chaque colonie ne provient que d’un seul germe, la formule suivante permet de connaître la concentration bactérienne pour une DO donnée.

N=ⁿ

d ^(3.2)

AvecN la concentration bactérienne en nombre de bactérie/ml,nle nombre de colonies dénombrées etdle facteur de dilution.

Pour une DO de 0,23 nous obtenons une concentration d’environ 9, 2.10⁷bactéries/ml.

3.4.3 Protocole de préparation des bactéries

Le protocole de préparation des bactéries, que nous allons utiliser pour nos expériences, débute par une étape de conservation jusqu’à la préparation des échantillons à analyser.

La solution finale doit contenir 80% de suspension bactérienne, 10% de sources de carbone sous forme de glucose et 10% de résazurine. Les sources de carbone sont préparées séparément à partir

3.5. Conclusion

d’une solution mère de glucose filtrée à 0,22µm et diluées avec de l’eau DI stérile. En sachant que la concentration en glucose finale est de 10% de la solution totale, nous devons préparer une source de carbone 10 fois concentrée par rapport à la concentration finale souhaitée. L’équipe de biologistes du CBAC a défini une concentration bactérienne idéale dans l’échantillon de 1.10⁸bactérie/ml. Elle correspond à une DO de 0,22 avec notre spectromètre.

Toutes nos expériences ont été menées avec une soucheE. Colique nous avons récupérée sous forme congelée, et constitue notre réserve. Nous avons dans un premier temps réalisé une pré-culture. Les bactéries congelées ont été mises en suspension dans un tube à essai contenant du milieu LB liquide et placées dans un incubateur agitant à 30°C durant une nuit. Au matin, la DO de la pré-culture est mesurée, et une culture est lancée à partir d’une DO de 0,05, la culture est placée sous incubation et agitation à 30°C pendant 2h. En parallèle, nous avons préparé une solution bactérienne, à partir de la pré-culture, à une DO de 0,1 dans du LB afin d’ensemencer une boite de Pétri contenant du LB-gélose, pour constituer un stock pour une utilisation régulière. La culture est ensuite amenée à une DO de 0,27, car la DO finale de 0,22 doit tenir dans 80 % du volume final. Elle est ensuite centrifugée¹afin de séparer les bactéries du milieu de culture, puis lavée avec une solution de sulfate de magnésium (MgSO₄) à 10⁻²mol/l. Les étapes de centrifugation et lavage sont répétées trois fois afin d’enlever toute trace de carbone organique contenu dans le milieu de culture. Une dernière étape de centrifugation est alors réaliser afin de remplacer la solution de lavage par le milieu M9. La densité optique est à nouveau mesurée et ajustée à 0,27. Les bactéries sont réservées dans la glace afin de stopper leur croissance. Enfin, la résazurine et la solution de source de carbone sont mélangées avec la solution bactérienne afin de réaliser la solution finale. La densité optique de cette préparation est alors d’environ 0,22.

3.5 Conclusion

Nous avons résumé, dans ce chapitre, les procédés de fabrication des dispositifs « macro » et « micro » et les techniques d’intégration des capteurs optique.

Dans un objectif, in fine, de mesure sur site, nous avons réalisé le dispositif « macro » en version automatisée et nous l’avons intégré dans une mallette thermostatée. Nous retiendrons, de l’automate, que le choix des éléments électro-fluidiques dépend grandement de l’architecture fluidique du système et de la vitesse de remplissage désirée. Nous avons choisi, pour ce prototype, une micro-pompe à solénoïde, qui offre une grande précision des volumes injectés, mais cela, au détriment du débit. Nous avons réalisé deux dispositifs « micro », en technologie verre-PDMS. Le premier a été réalisé pour y intégrer une optode, mais il comportait un défaut de remplissage. Ainsi, un second dispositif a été fabriqué afin de résoudre ce défaut et pour l’utilisation d’un second capteur : la résazurine. Les réservoirs et les canalisations ont été structurés dans le PDMS grâce à un moule en SU8. Une lame de

verre de microscope a permis de fermer les puces. A travers ce chapitre, nous avons vu la difficulté d’intégration des optodes dans les biopuces. En effet, contrairement à la résazurine, qui est liquide et s’intègre facilement dans l’échantillon, l’optode a nécessité d’être placée sur un capot en verre enduit de SU8. Les techniques classiques de collage, plasmaO₂, n’ont pas pu être utilisées pour les biopuces avec optode, au risque de les détruire.

Nous avons décrit, également, la réalisation du lecteur de fluorescence de la résorufine. Nous avons choisi les composants optiques (LEDs, photodiodes et filtres) en fonction des caractéristiques de la résorufine et du coût des composants. Nous avons pu réaliser un lecteur, qui répond à nos exigences, avec des composants traditionnels. Chaque composant a été caractérisé, à l’aide d’un banc de mesure optique, afin de connaître précisément leurs caractéristiques. Notons, d’une manière générale, que les caractéristiques fournies par le fabricant sont parfois éloignées de la réalité. Un logiciel permettant de commander le lecteur a été développé en LabWindows CVI.

Finalement, nous avons décrit les milieux de culture utilisés pour nos expérimentations : le milieu LB pour la culture et le milieu M9 pour les tests. Nous avons présenté, également, le protocole de préparation des bactéries et des échantillons de tests.

4 Résultats expérimentaux et

interpréta-tions

Ce chapitre présente les résultats expérimentaux visant à valider le principe d’une mesure de DBO par le suivi de la consommation d’oxygène d’une population bactérienne, en fonction de la concentration en produits carbonés.

Nous présenterons, tout d’abord, les courbes de consommation d’oxygène par les bactéries, mesurées grâce aux optodes. Nous verrons, ensuite, les expériences basées sur la dégradation de la résazurine, induisant une fluorescence fonction de l’activité bactérienne. Nous étudierons certains facteurs d’influence tels que, la température d’incubation, la concentration en carbone organique présente dans l’échantillon ou encore la concentration initiale en biomasse. Nous évaluerons les performances potentielles d’un tel principe. Nous commenterons les résultats obtenus et proposerons un modèle théorique qui témoignera de la conformité du comportement bactérien mesuré avec les mécanismes biologiques connus de la croissance bactérienne. Nous l’utiliserons pour en extraire, au plus tôt de la dynamique de croissance, des indicateurs représentatifs de la DBO, ou de la charge carbonée.

4.1 Principaux résultats expérimentaux

Nous allons résumer, dans cette première partie, les résultats des expériences réalisées sur nos systèmes « macro » et « micro », intégrant soit une optode, soit la résazurine. Nous verrons, au travers de certains facteurs d’influence, les zones de validité de mesure et les limitations des systèmes.

4.1.1 Mesure de la consommation bactérienne en oxygène sur le macrosystème à