(1) Extraction, purification
La méthode utilisée est adaptée de celle décrite par Sambrook et al. (1989). L’opération d’extraction de l’ADN est réalisée pour chacune des cinq souches (A365, A496, A060, A601, A700). La souche est inoculée dans un volume de deux fois un litre de milieu de Zobell (Oppenheimer et Zobell, 1952) mis en agitation pendant 48 heures à température ambiante (18/23°C).
La récupération du matériel bactérien se fait par centrifugation, 20 min à 4000g. Le surnageant est éliminé et le culot repris dans 32 mL de tampon TE (Tris-base 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). Ce volume est centrifugé 15 min à 4000g. Le surnageant est éliminé et le culot repris dans du tampon TENA 1X (TE, + NaCl 0,042 M). Les bactéries sont alors lysées par ajout de 0,5 mL de N-laurylsarcosine (Sigma) 10% pour 5 mL de suspension bactérienne, de 0,5 mL de Sodium-dodécyl-sulfate 10%, puis de 100 µL d’une solution de Protéinase K
(Sigma, solution à 20 mg.mL-1; concentration finale 0,33 mg.mL-1) ou d’une solution de
pronase E à 60 mg.mL-1. Après chaque ajout, les tubes sont agités 30 secondes par
retournement. La suspension bactérienne est mise à incuber au bain-marie à 45°C pendant trois heures, sous agitation, jusqu’à lyse complète. L’extraction de l’ADN est réalisée sur le produit de lyse en ajoutant un volume de PCI (phénol-chloroforme-isoamyl alcool 25-24-1, Sigma) sous une hotte aspirante. Après agitation, les tubes sont centrifugés 10 minutes à 9000g. La phase aqueuse supérieure est récupérée. L'opération est répétée une ou deux fois jusqu'à disparition de la plus grande partie du précipité protéique à l'interface. La qualité de
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cette déprotéinisation permet d’assurer la réussite de l’étape suivante d’élimination des ARN.
Pour cela 60 µL de ribonucléase A (réf. 9009, Sigma, 10 mg.mL-1, portée à 100°C au
bain-marie pendant 15 min pour éliminer les déoxyribonucléases) sont ajoutés et la solution est mise à incuber 1 heure au bain-marie agité à 60°C.
Une nouvelle série d’extractions au PCI est alors réalisée selon le protocole décrit ci-dessus. Puis pour éliminer les traces de phénol, une extraction est réalisée avec un volume de chloroforme. Après récupération de la phase aqueuse supérieure, l’ADN est précipité en ajoutant deux volumes d'éthanol absolu glacé (-20°C). Pour précipiter la totalité de l’ADN, la solution peut alors être placée une nuit à -20°C. Sinon, l'ADN est récupéré soit enroulé au bout d'une pipette Pasteur soit par centrifugation, avec élimination de l'éthanol, et disposé dans un tube propre puis centrifugé. Le culot d’ADN est rincé trois fois avec de l’éthanol à 70%, puis séché (étuve à 50°C) et repris dans 0,5 à 1,5 mL de tampon TE.
La quantité d’ADN ainsi obtenue est en général importante (plusieurs milligrammes) mais sa qualité est rarement suffisante pour réaliser une hybridation ADN/ADN. Une opération supplémentaire de purification est nécessaire. L’ADN est tout d’abord repris dans 4 mL de TE auquel sont ajoutés 80 µL de SDS à 10% et 20 µL de Protéinase K (solution à 20
mg.mL-1). Le tout est mis en incubation au bain-marie 3 heures à 37°C. Après incubation, les
opérations déjà décrites ci-dessus - extraction au PCI, puis au chloroforme, précipitation à l’éthanol absolu, rinçage à l’éthanol à 70%, séchage, dissolution dans le TE - sont reprises.
(2) Qualité de la purification
Le degré de pureté des différents ADN ainsi obtenus (de 0,5 à 2 mg) est ensuite contrôlé en utilisant quatre tests.
L’ADN est dilué dans du TE, de façon à obtenir une densité optique (DO) à 260 nm proche de un (blanc = tampon TE, cuve quartz de 10 mm). En effet les bases de l’ADN ont la propriété d’absorber à 260 nm. Quand la dilution voulue est obtenue, les DO à 260, 280 et 320 nm sont enregistrées. Deux coefficients sont calculés à partir de ces données et un balayage spectral (190/400 nm) est réalisé.
Calcul des coefficients
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Ce coefficient doit être compris entre 2 et 2,3. Il donnerait une information sur la présence d’ARN. Une contamination trop importante se traduirait par un dépassement de la valeur 2,3. Dans la pratique, et si tous les autres tests sont bons, la valeur de ce coefficient peut atteindre 2,6.
Estimation de la quantité d’ADN
La quantité d’ADN dissous dans le TE peut être évaluée en appliquant la règle suivante:
ADN (µg.mL
-1) = (DO
260nm- DO
320nm) x 50.
La validité de cette relation est reconnue pour une gamme de DO comprise entre zéro et un, la meilleure précision étant obtenue pour des valeurs proches de un.
Balayage spectral
La courbe de DO mesurée entre 190 nm à 400 nm doit présenter une ligne de base stable et proche de zéro avec un pic marqué à 260 nm (un second pic plus fin est également présent aux environs de 215 nm et est du à des traces de chloroforme).
Courbe d’hyperchromicité
Principe: l’ADN est composé d’une double hélice (ADN double brins) dont la structure
est maintenue par des liaisons hydrogène (liaisons faibles). Sous l’action de la chaleur ces liaisons sont rompues et l’ADN se sépare en deux mono-brins. La température à laquelle la séparation se réalise est appelée température de fusion (Tm) et est caractéristique de l'ADN testé. Ce phénomène est visualisé par l’augmentation rapide de la densité optique à 260 nm (hyperchromicité). En effet, ce sont les bases qui absorbent la lumière et celles-ci sont parfaitement ordonnées en plans parallèles dans la structure double-brins. Au moment de la séparation des brins (fusion), l’ordonnancement est modifié, les bases se décalent partiellement, le coefficient d’extinction est maximal et la DO augmente. L’importance de l’augmentation de la DO260nm au cours de la fusion est liée à la qualité de l’ADN présent dans la solution. Les ADN de référence, utilisés dans ce travail, et commercialisés comme ultra-purs, présentent une hyperchromicité mesurée de l’ordre de +24 à +34%. Dans la pratique, une hyperchromicité de + 18/20% permet d’obtenir des résultats satisfaisants.
Protocole: l’ADN est dilué dans du TE de façon à obtenir une DO260nm de l’ordre de 0,3 à 0,4. Les cuves de quartz contenant le témoin et l’échantillon sont thermostatées par un système de circulation d’eau issue d’un bain-marie régulé électroniquement (Bain-marie HAAKE D8, régulateur HAAKE PG20). Celui-ci est réglé sur une augmentation de 0,5°C par minute. Une sonde thermique est placée dans la cuve contenant l’ADN en solution et le spectrophotomètre enregistre toutes les 20 secondes la DO en fonction de la température. Un logiciel intégré permet de tracer la courbe d’augmentation de la DO en fonction de la température. Il détermine également la température correspondant au point d’inflexion de la courbe (= Tm) (Spectrophotometer UVIKON 941, Kontron instrument).
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