Cette analyse a été effectuée par S. Corre (MICROMER) sur le matériel informatique du laboratoire de microbiologie de la Station Biologique de Roscoff.
Les résultats des 95 tests du système GN MicroplatesTM sont codés de la manière
suivante: 1 (résultat positif) 0 (résultat négatif). L’analyse mathématique est réalisée selon les méthodes décrites par Sneath (1972) et Sneath et Sokal (1973) et utilise le principe d’égalité de poids des caractères phénotypiques, un indice de similitude et la méthode d’agrégation selon la variance. La représentation graphique de ces classifications hiérarchiques se fait sous forme d’un dendrogramme.
C. Résultats
Les résultats des tests de caractérisations phénotypiques des souches du groupe A365 sont présentés dans le Tableau 3, p.16.
En dehors des caractéristiques classiques des bactéries du genre Vibrio, c’est à dire l'aptitude à fermenter le glucose, la présence d’une cytochrome oxydase, le NaCl indispensable à la croissance, la présence d’un flagelle polaire, les particularités des souches du groupe A365 se situent, entre autres, dans leur faible capacité d’utilisation des substrats carbonés, avec des réactions positives pour seulement 35% des substrats testés. Elles ne se différencient pas uniquement par des tests négatifs. Certains de ses caractères ne sont partagés que par quelques espèces de vibrios: l'essaimage ou étalement des colonies en nappe sur l’agar ( swarming en anglais) avec V. alginolyticus et V. proteolyticus uniquement, la synthèse d’alginase avec V. harveyi, V. pelagius et V. splendidus; L’utilisation du rhamnose et de la bétaïne avec V. natriegens.
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à l’analyse, 10 présentent moins de 70% de caractères communs avec les souches du groupe. Seul V. logei s’en rapproche avec 90% de similitude.
Ce type d’analyse, s'il permet, grâce à un grand nombre de caractères, de différencier ou de mesurer l’homogénéité d’un groupe de souches, n'est pas adapté à établir des relations phylogéniques.
La réponse des souches du groupe A365 aux différents substrats n’est pas la même qu’avec la méthode de Baumann et Baumann (1981). Sur 31 caractères étudiés et communs aux deux méthodes, 12 donnent des résultats différents, le plus souvent en faveur du système Biolog:
Tableau 2. Comparaison des résultats des tests d’utilisation selon la méthode utilisée: test Biolog; (1) Baumann et Baumann (1981). Résultats en pourcentage de souches positives (A365, A496, A060, A601, A700).
tests d’utilisation réponse méthode Biolog réponse méthode
Baumann(1) glycérol 80% 100% rhamnose 0% 100% D-glucose 100% 0% tréhalose 100% 0% acétate 40% 0% propionate 20% 0% méso-inositol 10% 80% L-sérine 100% 0% L-leucine 20% 0% glutamate 100% 20% L-ornithine 100% 0% L-histidine 0% 100% L-proline 100% 0%
Ces différences dans les réponses confirment l’importance de standardisation des tests phénotypiques et de comparaison des résultats avec des méthodes identiques.
La Figure 1 (p.19) montre les deux types de flagelles qui ont pu être observés. Dans le cas où les bactéries sont cultivées en milieu liquide, elles présentent un flagelle polaire unique. Dans le cas de croissance sur milieu solide, les bactéries montrent, en plus du flagelle polaire, de multiples flagelles latéraux. Ces derniers ont un diamètre inférieur à celui du flagelle polaire.
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Tableau 3. Principaux caractères des souches du groupe A365.
Caractères % de souches (+)
A365T Caractères % de souches (+)
A365T
Fermentation du glucose 100 + Utilisation
Production de gaz à partir du glucose
0 - D-Mannose 0 -
Flagelles latéraux (milieu solide) 100 + D-Galactose 0 -
Flagelle polaire (milieu liquide) 100 + D-Fructose 0 -
Essaimage (swarming) 100 + Sucrose 20 -
Oxydase 100 + Maltose 100 +
Catalase 100 + Cellobiose 0 -
Production d’indole 0 - Mélibiose 0 -
Réduction du nitrate 100 + Salicine 0 -
Voges-Proskauer 0 - D-Gluconate 0 -
Arginine dihydrolase 0 - Succinate 100 +
Lysine décarboxylase 0 - Citrate 0 -
Ornithine décarboxylase 0 - méso-Erythritol 0 -
Hydrolyse de l’ONPG 0 - D-Mannitol 0 -
Alginase 100 + Glycérol 100 + Amylase 100 + L-Tyrosine 60 + Gélatinase 100 + D-Sorbitol 0 - Tween-estérase 100 + D-Xylose 0 - Déoxyribonucléase 100 + L-Arabinose 0 - Croissance à : L-Rhamnose 100 + 4°C 80 + D-Glucose 0 - 18°C 100 + Tréhalose 0 - 22°C 100 + Galacturonate 0 - 30°C 40 + Acétate 0 - 35°C 20 - Propionate 0 -
Croissance en présence de : Butyrate 0 -
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Caractères % de souches (+)
A365T Caractères % de souches (+) A365T Acidification: Utilisation D-Mannose 0 - L-α-Alanine 100 + D-Xylose 0 - L-β-Alanine 0 - Maltose 100 + DL-Sérine 0 - D-Glucose 100 + L-Leucine 0 - L-Arabinose 0 - L-Valine 60 + L-Rhamnose 0 - L-Aspartate 100 + Glycérol 0 - L-Glutamate 20 - Mélibiose 0 - L-Arginine 0 - Sucrose 0 - L-Lysine 80 + D-Galactose 0 - L-Ornithine 0 - D-Sorbitol 0 - L-Histidine 100 + D-Cellobiose 0 - L-Proline 0 - Fructose 0 - Bétaïne 100 + myo-Inositol 0 - Fumarate 100 + méso-Erythritol 0 - Glucosamine 0 -
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Tableau 4. Dendrogramme réalisé à partir de l’analyse en taxonomie numérique des résultats du système GN MicroplatesTM (Biolog Inc., Hayward, Calif.). Le dendrogramme inclut les 5 souches du groupe A365 (A365, A496, A060, A601, A700) et 11 autres espèces du genre Vibrio.
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Figure 1: Photos en microscopie électronique d’une cellule de la souche A365 (souche type), coloration négative, montrant un flagelle polaire (gauche) en milieu liquide, ou de multiples flagelles latéraux (droite) sur milieu solide. [x 14000].
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D. Séquençage, phylogénie ARN16S
Ce travail a été réalisé au sein du laboratoire par Valérie CILIA, dans le cadre d’un projet transfert de méthodes de séquençage de bactéries à des fins d’identification .
Les récentes évolutions de la systématique bactérienne donnent une importance croissante à l’analyse comparative des séquences des gènes de l’ARN ribosomique (fraction 16S). La validité de ces analyses repose sur le principe selon lequel le degré de similitude entre les séquences des gènes de deux organismes est proportionnel à leur degré de parenté, donc au temps écoulé depuis leur séparation (Wilson et al., 1977, Scharwtz et Dayhoff, 1978). L’intérêt de ces analyses est d’obtenir un arbre généalogique des espèces (phylogénie) en respectant le principe du regroupement cladistique, c’est à dire le regroupement des descendants d’un ancêtre unique. Le choix du gène a été longtemps problématique. Aujourd’hui le gène codant pour la sous-unité 16S de l’ARN ribosomique s’est imposé en taxonomie bactérienne pour ses qualités: présence universelle, fonction conservée, pression de sélection peu dépendante des conditions du milieu externe, alternance de domaines variables et conservés (Fox et al. 1977, Woese et Fox, 1977; Woese, 1991). L’apport le plus significatif de ce type d’analyse par rapport aux analyses classiques a été la mise en évidence par Woese
et al. en 1990 de l’existence de trois règnes: les eucaryotes et deux divisions des procaryotes
(eubactéries et archaebactéries).
A partir de la séquence du gène de l’ARNr16S de la souche type (A365), une analyse phylogénétique est menée par trois méthodes mathématiques. Le nom de Vibrio pectenicida (pec.ten.i.ci’da.: de Pecten, nom de genre de la coquille Saint-Jacques; caedo, tuer;
pectenicida, qui tue les coquilles Saint-Jacques) est attribué à la souche A365 au cours de
cette étude.
1.
Matériel et méthodes
La première étape consiste donc à réaliser le séquençage de l’ADNr en utilisant la méthode décrite par Ruimy et al. (1994), puis d'aborder l'analyse plylogénétique proprement dite en comparant la séquence obtenue à celles d'autres ADNr16S bactériens.
a)