Protocole du transfert hydrogénant par les métalloenzymes artificielles

1.3.1. Quantification des sites actifs des protéines hôtes

L’avidine et la streptavidine possèdent chacune quatre sites capables de fixer la biotine ou ses dérivés. En réalité, lors de la production de (strept)avidine, de la biotine est présente dans le milieu de culture et se fixe dans la protéine. Bien que différentes étapes de dénaturation et dialyses successives permettent d’en éliminer la majeure partie, une certaine quantité de biotine occupe toujours quelques sites. Afin d’être certain que tous les complexes biotinylés sont fixés par la protéine, on introduit un défaut de complexe par rapport au nombre de sites qu’il faut déterminer au préalable. La titration des sites actifs est réalisée par les biologistes de notre équipe par fluorescence à l’aide de la biotine-4- fluorescéine (figure II.1.8) ou par lecture de l’absorbance à 506 nm pour le titrage réalisé avec HABA (figure II.1.8).[118]

Figure II. 1.8 : Structure de la biotine-4-fluorescéine et de HABA (acide 2-(4’- hydroxyazobenzène)-benzoïque.

La biotine-4-fluorescéine ne fluoresce plus lorsqu’elle est fixée dans la protéine. Ainsi l’ajout successif de ce réactif permet de tracer une courbe dont le point d’inflexion correspond à l’équivalence de sites actifs pour une masse donnée de protéine. Avec le HABA, il s’agit d’un titrage indirect. Ce réactif se fixe dans la (strept)avidine avec une affinité faible (103 M-1) pour former un complexe qui absorbe à 506 nm. Une fois la protéine saturée par HABA, l’ajout de biotine déplace quantitativement le HABA fixé. Au

fur et à mesure des ajouts, l’absorbance à 506 nm diminue jusqu’à un point minimal correspondant au nombre de sites actifs par masse de protéine.

Une fois le nombre de sites actifs connus, par masse de protéine, il est possible de calculer la masse molaire apparente de la protéine (Mx) correspondant à 4 sites actifs.

Un exemple de calcul est donné pour la streptavidine Wt de masse molaire M = 65700 Da et pour un nombre de sites actifs : Nbre Site = 3.7.

Mx = (M x 4) / Nbre Site

= (65700 x 4) / 3.7 = 71027 Da

Connaissant la masse molaire apparente (Mx) pour 4 sites actifs, une masse de protéine

prélevée permet de calculer le nombre de moles de sites actifs.

X moles de protéine = 4 X moles de sites actifs.

Pour être certains qu’aucun complexe biotinylé ne se trouve hors de la protéine durant la catalyse, le complexe est ajouté en défaut par rapport au nombre de sites actifs. Des tests en fonction du nombre d’équivalents de complexe montrent que la sélectivité varie peu de 1 à 4 équivalents avec un maximum autour de 3.5 eq. et baisse légèrement à partir du cinquième (annexe 1). Ainsi, 3.4 équivalents de complexe biotinylé sont ajoutés.

1.3.2. Mise en œuvre de la catalyse

Bien que cette réaction soit modérément sensible à la présence d’oxygène – une diminution maximale de 30 % de conversion est observée pour une catalyse réalisée sans précautions – toutes les solutions utilisées sont préalablement désoxygénées par un bullage d’azote. Après purification, la protéine est lyophilisée et se présente sous forme de poudre blanche floconneuse que l’on dissout dans l’eau. Cette solution de protéine, environ 5 à 6 mg / mL, est désoxygénée par un bullage d’azote pendant 45 min. Le complexe biotinylé est préparé puis utilisé tel quel. Sous forme de poudre, il peut être stocké sous azote durant

des mois sans observer de diminution de l’activité catalytique. Pour la catalyse, une partie aliquote de complexe est prélevée et solubilisée dans le DMF pour une concentration de la solution stock d’environ 0.039 M. Une solution stock de substrat est également préparée dans le DMF à une concentration 1 M. De cette façon, il y a un minimum de solvant organique dans le milieu de catalyse (moins de 1.5 % de DMF (v /v) pour un volume total de 1.2 à 1.3 mL). Les solutions de formiate ou tampon sont préparées dans l’eau et ajustées à pH = 6.25 avec des pastilles de soude broyées. La concentration finale, par tube de catalyse, est de 0.5 M en formiate de sodium et de 0.45 M en acide borique. Lors de la catalyse les réactifs sont ajoutés en séquence selon la figure II.1.9.

Protéine hôte (dans l’eau)

Complexe biotinylé (dans le DMF) Substrat (dans le DMF)

Source d’hydrure et tampon (dans l’eau)

Tube de catalyse

Protéine hôte (dans l’eau)

Complexe biotinylé (dans le DMF) Substrat (dans le DMF)

Source d’hydrure et tampon (dans l’eau)

Tube de catalyse

Figure II. 1.9 : Séquence d’ajout des réactifs dans le tube de catalyse du multi-réacteur.

La réaction dégageant du CO2, les catalyses sont effectuées dans un réacteur ouvert,

sous atmosphère inerte (figure II.1.10), afin de déplacer l’équilibre en favorisant l’élimination de CO2 (pour ne pas limiter la conversion). Après avoir chargé les réactifs, le

réacteur est fermé, purgé par 3 cycles de vide et azote successifs et finalement maintenu ouvert sur une ligne d’azote possédant une colonne de mercure capable d’évacuer une surpression sans être contaminé par l’oxygène extérieur (ligne de Schlenk).

Figure II. 1.10 : Multi-réacteur 24 puits avec un système de reflux et une entrée d’azote (Radley’s)

En fin de réaction le produit et le substrat, peu solubles dans l’eau, sont facilement récupérés par une extraction à l’éther (3 à 4 x 1 mL). L’analyse des résultats est effectuée par GC ou HPLC chirales. Une colonne chirale pour GC est sensible à la présence de sels ou de métaux, dont l’accumulation détériore rapidement la séparation des énantiomères. Afin d’éviter ce problème, les extraits éthérés sont préalablement filtrés sur silice avant l’injection en GC. De manière à s’assurer qu’il n’y a pas d’enrichissement énantiomérique lors de cette purification, la totalité des produits et substrats sont élués à l’éther (Rf moyen =

0.9). Des comparaisons, réalisées entre des échantillons filtrés et non filtrés, montrent que la conversion et l’excès énantiomérique sont identiques et qu’il n’y a pas d’enrichissement en produit ou en substrat lors de cette étape de purification.