La méthode de production choisie est la méthode d’extrusion avec adjonction d’un flux d’air coaxial (Figure 24 et 25). Le générateur de billes utilisé a été conçu et développé dans le cadre de cette thèse.
air comprimé pompe bain de polymérisation filtre à air solution d’alginate buse
Figure 24 : Banc expérimental pour la production de billes d’alginate
Arrivée d’air Arrivée de la solution d’alginate Sortie au goutte à goutte de la solution d’alginate Buse Support de la buse
Figure 25 : Schéma descriptif de la buse
La pompe péristaltique (ISMATEC IPC) alimente le circuit de production de billes (5 ml/min) placé sous hotte à flux laminaire. Le débit du flux d’air coaxial est indirectement contrôlé par une mesure de pression par un manomètre. Pour former une bille de 2 millimètres, le débit du flux d’air coaxial est fixé à 5 ml/min contre 12,5 ml/min pour une bille de 1 millimètre. La distance de chute est de 10 centimètres.
manomètre manodétendeur débitmètre
La solution d’alginate (Sigma) tombe dans 150 ml d’un bain de réticulation (chlorure de calcium ; 17g/l ; pH 7,4 ; 20 °C). Le temps d’immersion est de 15 minutes. Les billes sont ensuite rincées par deux fois dans du sérum physiologique. Le stockage se fait dans cette même solution à 4 ° C.
• Composition de la solution à extruder : pH 7,4 ; stérile (filtration sur filtre 0,45µm) NaCl 154 mM
Hepes 10 mM Alginate 2,2 %
• Composition du bain de réticulation : pH 7,4 ; stérile (autoclave) NaCl 154 mM
Hepes 10 mM CaCl2 75 mM
• Composition de la solution de sérum physiologique : pH 7,4 ; stérile (autoclave) NaCl 154 mM
Hepes 10 mM KCl 2,7 mM Na2HPO4, 12H2O 0,28 mM
2.Culture d’hépatocytes C
3a
La mise en place de ce protocole a été rendue possible par la collaboration avec l’équipe du PR. M.D.Nagel à l’UTC. Les cellules de foie humain C3a fournies par ATCC (American Type Culture Collection) sont cultivées dans du milieu Minimum Essential Medium Earles salts, L-glutamine (Gibco) complémenté avec 1 % de solution 100 x concentrée de pénicilline, 1 % de solution de Non-essential Amino Acids (Gibco), 1 % de Hepes Buffer solution 1 M (BicoBRL), 1 % sodium pyruvate 100 mM (GibcoBRL) et de 10 % de sérum de veau fœtal (Gibco) sous hotte à flux laminaire. Les cultures sont incubées dans une étuve humide à 5 % de dioxyde de carbone à 37°C.
La culture d’hépatocytes humain C3a n’est pas aisée. Il convient de respecter certaines règles :
• Les hépatocytes C3a présentent des difficultés à adhérer à la surface des boites ou flacons de culture. Lorsqu’un type de boite (marque) paraît adapté, il convient de ne pas en changer. Nous avons utilisé des boites de marque Falcon.
• Le milieu de culture doit être renouvelé tous les 3 jours. Si le milieu est renouvelé régulièrement et en quantité suffisante (20 ml de milieu de culture pour une boite de 75 cm3), les cellules peuvent être maintenues quelques semaines (au maximum 3) à confluence, (c’est à dire lorsque les cellules recouvrent entièrement le fond de la boite de culture).
• Les passages (multiplication des cellules par division d’une population mère) doivent être effectués à une densité suffisante (5 millions de cellules par boite de 75 cm3) pour assurer une reprise de la division dans la boite de repiquage. La dissociation des cellules doit être poursuivie jusqu’au stade 2 à 3 cellules. Les amas cellulaires résultants d’une mauvaise dissociation, après adhésion sur la surface de la boite, voient leur viabilité chuter entraînant avec eux l’ensemble des cellules de la boite. Le temps nécessaire à l’adhésion des cellules à la surface de la boite de culture est comprise entre 12 à 15 heures.
• Après décongélation, les mêmes consignes doivent être appliquées. Il faut souligner que les hépatocytes C3a sont longs à reprendre leur division après décongélation. De plus, avant utilisation de ceux-ci, il convient d’effectuer un minimum de 2 passages afin que les cellules retrouvent une activité métabolique satisfaisante.
3. Protocole de bioencapsulation
3.1.Dissociation des cellules
Les hépatocytes C3a à confluence (environ 15 à 20 millions de cellules par boite), adhérents a la boite de culture, sont lavés 1 fois avec une solution de trypsine EDTA (0,225%) à 37 ° C puis incubés avec 3 ml de trypsine EDTA pendant 5 à 10 minutes à 37 ° C. La
dissociation est suivie régulièrement sous microscope à contraste de phase. Les cellules sont reprises dans 7 ml de milieu de culture MEM SVF 10 %. Une dissociation mécanique est assurée par pipetage jusqu'au stade 3 cellules. Une numération est pratiquée à l’aide d’une cellule de Malassez. La viabilité cellulaire est mesuré par un test au bleu trypan.
3.2.Préparation du mélange alginate-hépatocytes
Le contenu du flacon est transféré dans un tube puis centrifugé à 1000 tours par minute pendant 5 minutes à 4 ° C. Le culot cellulaire est suspendu dans 1 ml de solution de préparation de gel alginate (NaCl 154 mM ; Hepes 10 mM) pH 7,4 à 37 ° C puis mélangé dans 9 ml de gel alginate (NaCl 154 mM ; Hepes 10 mM ; Concentration finale d’alginate 2,2 %) à 37 ° C. La solution résultante est homogénéisée délicatement en évitant la formation de bulles.
3.3.Coulage des billes
La formation des billes est décrite au paragraphe 1. Le temps d’immersion de 15 minutes dans le bain de chlorure de calcium est décompté à partir de la dernière bille formée. Après élimination du bain de chlorure de calcium, les billes sont rincées 2 fois avec une solution physiologique (NaCl 137 mM ; Hepes 10 mM ; KCl 2,7 mM ; Na2HPO4 0,28 mM) pH 7,4 à 4 ° C, puis 1 fois avec du MEM Earles salts, L-glutamine à 37 ° C. Les billes sont mises en culture dans 30 ml de MEM SVF 10 % à 37 ° C (Figure 26).
Figure 26 : Billes d’alginate hébergeant des hépatocytes C3a (Microscopie optique ; grossissement x 100)
3.4.Evaluation du nombre de cellules et de leur viabilité.
Sur fond de boite, le nombre de cellules et leur viabilité sont évaluées par comptage en cellules de Malassez et par un test au bleu trypan, après détachement des cellules par trypsination au terme de la manipulation.
Le rendement d’encapsulation, c’est à dire le nombre de cellules encapsulées par rapport au nombre de cellules contenues dans le culot cellulaire de départ, a été déterminé. Pour chaque mesure, 50 billes sont isolées puis incubées dans 5 ml de citrate de sodium (chélateur de calcium) pH 7,4 pendant 15 minutes à 37 ° C sans agitation. Les billes sont complètement dissoutes par rupture des liaisons calcium. On ajoute 5 ml d’une solution physiologique (NaCl 137 mM ; Hepes 10 mM ; KCl 2,7 mM ; Na2HPO4 0,28 mM). La solution est centrifugée 5 minutes à 1000 tours par minute. Le test au bleu trypan a été préféré au test MTT pour l’évaluation de la viabilité cellulaire. En effet, ce colorant vital présente l’avantage de ne pas réagir avec l’alginate au contraire du MTT. Après élimination du surnageant, les cellules sont suspendues dans 200µl de PBS puis incubées avec 50µl de bleu trypan pendant 7 minutes et enfin comptées en cellule de Malassez.
• Solution de citrate de sodium : pH 7,4 ; stérile (filtration sur filtre 0,22µm) Sodium citrate (hydrous) 23,3g/l
Citric acid (hydrous) 3,27g/l Sodium biphosphate 2,22g/l
Dextrose 25g/l
Adenin 0,27g:l