Protéines de l’hôte impliquées dans l’infection du foie par Plasmodium

Si les facteurs parasitaires impliqués dans l’entrée restent à identifier, plusieurs protéines des hépatocytes ont été impliquées dans l’entrée des sporozoïtes, notamment 3 facteurs d’entrée du virus de l’hépatite C : la tétraspanine CD81, le scavenger recepteur BI (SRBI) et le récepteur d’Éphrine EPHA2.

CD81, initialement décrite comme récepteur hépatique pour la glycoprotéine d’enveloppe E2 du virus de l’hépatite C (Pileri et al. 1998), joue un rôle majeur dans l’infection par les sporozoïtes de P. falciparum et P. yoelii (Silvie et al. 2003; Silvie et al. 2006). CD81 est une protéine de 26kDa, qui appartient à la famille des tétraspanines, des protéines à quatre domaines transmembranaire retrouvées sur de nombreux types de cellules et impliquées dans divers processus biologiques tels que l’adhérence cellulaire, la migration, la fusion cellulaire, la co-stimulation, la transduction du signal et la différenciation cellulaire. Comme les autres tétraspanines, CD81 interagit avec de nombreux partenaires à la surface des cellules, notamment des intégrines et des molécules de la superfamille des immunoglobulines, au sein de microdomaines membranaires riches en cholesterol (Charrin et al. 2009). Les travaux du laboratoire ont montré que CD81 est nécessaire à l’infection par P. falciparum et P. yoelii (Silvie et al. 2003; Silvie et al. 2006). En revanche, P. berghei peut infecter les cellules en présence ou non de CD81 (Silvie et al. 2003). CD81 n’est pas impliqué dans la migration des sporozoïtes à travers les cellules mais est indispensable à la pénétration des parasites par formation d’une vacuole parasitophore, elle-même indispensable à la différenciation en mérozoïtes chez P.

falciparum et P. yoelii. Les différentes études montrent l’existence de plusieurs voies distinctes d’invasion des sporozoïtes de P. berghei, qui sont capable d’infecter un large éventail de types cellulaire in vitro (Silvie et al. 2007).

En 2008, deux études ont montré l’importance de SR-B1, un autre récepteur de l’hépatite C, lors de l’infection par Plasmodium. Une première étude a montré que SR-B1 augmente de manière significative la permissivité des hépatocytes à l’entrée de P.

falciparum et P. yoelii spécifiquement (Yalaoui et al. 2008), par utilisation d’anticorps ou

de cellules knock-out. Ils ont également montré que SR-B1 agit via la régulation du cholestérol membranaire et de CD81, pour rendre la cellule hautement permissive à la pénétration du sporozoïte. L’importance de SR-B1 a également été montrée par l’utilisation d’ARN interférence pour l’infection de P. berghei dans des cellules Huh7, et la surexpression de SR-B1 a conduit l’augmentation de l’infection (Rodriguez et al. 2008).

56 CD81 n’est pas nécessaire à l’infection des Huh7 par P. berghei (Silvie et al. 2007), ce qui suggère un possible rôle de SRBI indépendant de CD81.

Une autre protéine cellulaire a été identifié comme jouant un rôle dans l’invasion des sporozoïtes de Plasmodium, il s’agit du récepteur d’éphrine A2 (EPHA2) présent à la surface des hépatocytes, et permettant la permissivité de ces cellules à l’infection par

Plasmodium (Kaushansky et al. 2015). EPHA2 appartient à la sous-famille des récepteurs

d’éphrine, une famille de protéines tyrosine kinases impliquées dans les interactions cellulaires. Kaushansky et collaborateurs ont montré que les cellules sur-exprimant EPHA2 étaient plus permissives à l’infection par P. yoelii, alors que l’infection est réduite chez les souris EPHA2^-/^- (Kaushansky et al. 2015). Les auteurs ont proposé un lien entre la protéine à domaine 6-cys P36 et EPHA2 au cours de l’infection des hépatocytes, mais l’importance fonctionnelle de EPHA2 et son éventuelle interaction avec P36 restent à démontrer.

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58 L’infection des hépatocytes par les sporozoïtes de Plasmodium est une étape initiale et obligatoire du développement du parasite chez l’homme, et constitue une cible idéale pour des approches vaccinales contre le paludisme. Cependant, les mécanismes impliqués dans l’entrée des sporozoïtes dans les hépatocytes restent très mal connus. Au cours de ma thèse, j’ai étudié les mécanismes d’invasion des hépatocytes par les sporozoïtes, avec les objectifs suivants :

1] Mise en place d’outils pour obtenir des parasites transgéniques fluorescents afin de suivre les différentes étapes d’invasion des parasites par cytométrie en flux et par microscopie à fluorescence.

Pour cela, nous avons développé une nouvelle stratégie, Gene Out Maker Out (GOMO), qui nous permet de modifier génétiquement le parasite tout en le rendant fluorescent (Résultat 1). Les protéines de rhoptries étant impliquées et sécrétées au moment de la formation de la jonction mobile, et par conséquent durant l’invasion productive, un étiquetage de ces protéines par mCherry chez P. yoelii nous a permis de suivre la sécrétion des rhoptries lors de l’invasion productive des cellules (Résultat 2).

2] Caractériser les cinétiques de traversée et d’invasion cellulaire des sporozoïtes.

Les parasites transgéniques fluorescents nous ont permis de différencier la traversée cellulaire de l’invasion productive dans le temps lors de l’infection des hépatocytes par les sporozoïtes. Nous avons mis en évidence la formation de vacuoles transitoires durant la traversée cellulaire, sans sécrétion des protéines de rhoptries, donc mettant en jeu un mécanisme différent de l’invasion productive. Par la même occasion, nous avons découvert que les sporozoïtes utilisent la perforin-like protein 1 (PLP1), une protéine impliquée dans la traversée cellulaire, pour sortir de cette vacuole transitoire et échapper à la dégradation par les lysosomes cellulaires (Résultat 3).

3] Etudier le rôle de protéines parasitaires sécrétées par les micronèmes au cours de l’invasion des hépatocytes par les sporozoïtes.

À l’aide d’approches génétiques, nous nous sommes intéressés à trois protéines de micronèmes des sporozoïtes : AMA1, une protéine également exprimée par les mérozoïtes et impliquée dans l’invasion des globules rouges, et P52 et P36, deux protéines de la famille 6-cys impliquées dans l’infection du foie. Malgré la mise en place de nouvelles stratégies de génétique moléculaire, il nous a été impossible d’invalider le gène ama1 chez les stades sanguins de P. yoelii, ce qui suggère un possible rôle essentiel lors de la phase érythrocytaire (Résultat 4). Par contre, nous avons pu générer et caractériser des parasites déficients pour les deux gènes p52 et p36, chez P. yoelii et P. berghei (Résultat 5).

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