La protéine de nucléocapside (NC)

Généralités

La protéine de nucléocapside (NC) est une petite protéine de 55 résidus, très basique (pI = 9.9), et qui contient deux domaines, chacun structuré autour d’un ion Zn2✔_{, dits domaines en doigts de zinc, avec la séquence consensus} suivante : CX2CX4HX4C [159] (voir Figure 2.6). On parle de doigt de zinc de type CCHC [160]. La NC est un composant très abondant des virions de VIH-1 dans lesquels elle est associée à l’ARN génomique. Elle est tout d’abord synthétisée comme une partie de la polyprotéine Gag et est ensuite clivée par la protéase virale jusqu’à sa forme mature de 55 résidus [161, 162].

2.1. Les acteurs 37 A G KE G I F N N K K R Zn M G KE G Q W D K K G T Zn IQKGNFRNQRKTV APRKK ERQAN 1 11 21 31 41 51 55 2+ 2+

Figure _{2.6 – Séquence de la NC du VIH-1}

La séquence est celle de l’isolat NL4-3. Les cystéines et les histidines qui coordinent les ions Zn2✔ _{sont représentés en gris. Les résidus aromatiques des doigts de zinc,}

i.e. F16 du doigt N-terminal et W37 du doigt C-terminal sont représentés en lettres

grasses.

La NC est une protéine de liaison aux acides nucléiques qui joue un rôle dans quasiment toutes les étapes du cycle réplicatif du virus, de l’encapsi- dation du génome et l’assemblage des virions jusqu’à la transcription inverse et l’intégration de l’ADN proviral. Ainsi, la protéine NC (ou le domaine NC du précurseur Gag) est impliquée dans la dimérisation de l’ARN génomique [163, 164], dans son encapsidation [165–167], dans l’hybridation de l’ARNt amorce au PBS [116, 168–170] (voir également Paragraphe 2.3), et dans les étapes de transfert de brins de la transcription inverse [171–173].

Nombreuses de ces fonctions consistent en un remaniement de structure d’acides nucléiques. La NC catalyse ces remaniements pour aboutir à la struc- ture la plus stable d’un point de vue thermodynamique. Ceci en fait une pro- téine chaperonne des acides nucléiques [174, 175].

Pour comprendre le rôle de la NC dans le processus de transcription in- verse, il est important de s’attarder sur les propriétés structurales et sur les propriétés de liaisons aux acides nucléiques de la NC. La plupart des infor- mations structurales disponibles, quant aux propriétés de liaisons aux acides nucléiques, réfèrent aux interactions de la NC avec le signal d’encapsidation Ψ. Bien que ces études ne soient pas directement reliées à la transcription inverse, nous en détaillerons quelques points essentiels.

Propriétés structurales

La structure des doigts de zinc individuels [176, 177] ainsi que celle de la protéine de pleine taille [178, 179] ont été déterminées en solution par RMN (voir Figure 2.7 A). Les structures montrent que le repliement global de chaque doigt de zinc est très similaire. Cependant, le doigt de zinc C-terminal semble être plus labile que le doigt de zinc N-terminal [176]. L’existence de faibles nOe (nuclear Overhauser effect) entre des résidus des différents doigts de zinc a tout d’abord permis de penser que les deux domaines étaient rela- tivement proches l’un de l’autre [179]. Une étude postérieure a confirmé les faibles nOe inter-doigts, mais a surtout révélé une structure très dynamique,

avec des temps de corrélation de rotation différents pour chacun des doigts de zinc, montrant ainsi que ces interactions inter-doigts sont plutôt transitoires et que les deux domaines évoluent indépendamment l’un de l’autre [180]. Dans cette étude, les extensions N- et C-terminales apparaissent aussi comme très flexibles, le tout semblant procurer à la NC une grande adaptabilité de liaison à différents partenaires de séquences et de structures variées.

W₃₇ F₁₆ I 24 M46

A

B

Figure _{2.7 – Structures RMN de la NC1-55 du VIH-1}

A: Structure RMN de la NC libre (PDB code 1AAF) [178]. B : Structure RMN de la NC1-55en complexe avec le signal d’encapsidation SL3 (PDB code 1A1T) [118]. Le

doigt de zinc N-terminal est représenté en bleu, le doigt de zinc C-terminal en rouge. Les extensions N- et C-terminale sont en vert clair. La tige-boucle SL3 est représentée en bleu cyan. Les résidus majeurs pour la reconnaissance sont représentés en jaune.

2.1. Les acteurs 39 Propriétés de liaison aux acides nucléiques

La NC possède 15 résidus basiques, Lysine ou Arginine, chargés positi- vement au pH physiologique (séquence de l’isolat NL4-3 - Figure 2.6). Ces charges lui assurent une interaction électrostatique, le plus souvent non spé- cifique, avec des acides nucléiques variés, tant ARN que ADN [181–185]. A l’intérieur du virion, elle recouvre ainsi entièrement l’ARN génomique, à rai- son d’une protéine de NC tous les 5 à 8 nucléotides [162, 181, 186–188]. La NC protège de cette façon l’ARN viral d’une dégradation par des nucléases. Ces interactions électrostatiques représentent une part importante des interactions entre la NC et les acides nucléiques. La fixation de la NC, tant à l’ADN qu’à l’ARN, est en effet fortement dépendante de la force ionique [181–185]. Ces propriétés ressemblent fortement aux interactions non spécifiques que peuvent établir des ligands polycationiques comme les polyamines ou la poly-Lysine.

A

B

NC - SL2

NC - SL3

Figure _{2.8 – Comparaison des structures NC1-55-SL2 et NC1-55-SL3}

A: Structure RMN du complexe NC1-55-SL2 (PDB code 1F6U) [119]. B : Structure

RMN du complexe NC1-55-SL3 (PDB code 1A1T) [118]. Le doigt de zinc N-terminal

est représenté en bleu, le doigt de zinc C-terminal en rouge. L’hélice 310 N-terminale

est représentée en mauve. Les tiges-boucles SL2 et SL3 sont représentées en bleu cyan.

Néanmoins, certaines interactions de la NC avec des acides nucléiques sont plus spécifiques. Les nombreuses études relatives à la fixation spécifique de la NC à des séquences particulières d’acides nucléiques réfèrent essentiellement au signal d’encapsidation Ψ. Celui-ci est constitué de quatre tiges-boucles (SL1, SL2, SL3 et SL4) situées en aval du PBS (Figure 2.4). La fixation de la NC aux tiges-boucles SL2 et SL3 est très forte (Kd = 20 ✏ 30 nM pour une force ionique physiologique), et plus importante que pour les tiges-boucles SL1 et

SL4 (Kd= 100 ✏ 320 nM) [185]. Les structures de la NC liée aux tiges-boucles SL2 et SL3 ont été déterminées par RMN en solution [118, 119]. La structure du complexe NC-SL3 est représentée Figure 2.7 B. Dans cette structure, il est intéressant de noter que chaque doigt de zinc réalise une poche hydrophobe venant reconnaître une base guanine de la boucle d’ARN. Les résidus majeurs formant ces poches hydrophobes sont les résidus aromatiques présents à la deuxième position de chaque doigt de zinc (i.e. F16 et W37 - Figure 2.6) ainsi que des résidus à chaîne latérale hydrophobe (i.e. I24 et M46). La partie N-terminale, quant à elle, se structure en hélice 310 lors de fixation à la tige boucle et vient se loger dans le grand sillon de la tige d’ARN.

Même si le mode de reconnaissance de SL2 est très comparable, en ce qui concerne chaque doigt de zinc, l’organisation globale du complexe NC-SL2 est différente. En effet, les doigts de zinc N- et C-terminaux adoptent une orienta- tion relative différente, et l’extension N-terminale, bien que se structurant de même en hélice 310, vient s’enchâsser dans le petit sillon de la tige [119]. La comparaison des structures des deux complexes est présentée Figure 2.8. Ces différences appuient le fait que la NC puisse reconnaître des séquences d’ARN variées avec des affinités comparables — la flexibilité de la partie N-terminale et du lien reliant les deux doigts de zinc lui conférant une grande adaptabilité. Ces études structurales, en accord avec de nombreuses études par spec- troscopie de fluorescence [181, 182], montrent que ces doigts de zinc de type CCHC, qui contiennent des résidus hydrophobes à des positions adéquates forment une surface idéale de reconnaissance pour les résidus guanine des boucles d’ARN. Il s’agit là d’un point important pour la compréhension des

Résultatsdes Chapitres 3 et 4.

Après avoir présenté les différents acteurs prenant part au processus de la transcription inverse, nous pouvons maintenant aborder la description de son déroulement, de l’initiation à la terminaison.