quelle paire de base, elles sont plus fortes avec les paires G C qu’avec les paires A✏U [458]. Il a ainsi été proposé que ces interactions de type A-mineur entre l’ARNr 16S du site P et la tige anticodon des ARNt puissent participer à la discrimination des ARNt initiateurs [459] — qui présentent trois paires G C caractéristiques dans leur tige anticodon (Figure 9.2). Cette hypothèse a en- suite été confirmée grâce à des expériences de mutagénèse [460]. Cependant ces seules interactions A-mineur ne semblent pas suffire à définir la spécificité de sélection IF3-dépendante de l’ARNtMet
f en tant qu’ARNt initiateur [460]. En effet, à l’heure actuelle des zones d’ombres persistent quant à l’étape de décodage IF3-dépendante au sein du site P du ribosome. Nous tâcherons dans le Paragraphe suivant de présenter les données communément admises concernant l’étape de décodage IF3-dépendante ainsi que les points restant à élucider.
9.4
La sélection IF3-dépendante de l’ARNt ini-
tiateur
Comme nous l’avons vu au Paragraphe 9.1, une des fonctions cruciales du site P de la petite sous-unité du ribosome est de fixer sélectivement l’ARNt initiateur sur le codon de démarrage de l’ARNm. Cette fixation sélective condi- tionne la fidélité de la synthèse protéique. Chez les bactéries, le facteur d’initia- tion IF3 induit la sélection des ARNt au site P au travers d’interactions avec la petit sous-unité du ribosome. Ce facteur entraîne en effet l’éjection des ARNt élongateurs présents au niveau du site P, et renforce au contraire la fixation de l’ARNtMet
f initiateur [461, 462]. Même si des changements conformationnels, induits par IF3, ont été décrits pour l’ARNm, l’ARNtMet
f fixé au site P et la sous-unité 30S du ribosome [427, 463, 464], le rôle de ceux-ci dans la sélection IF3-dépendante de l’ARNt initiateur n’a jusqu’alors pas été montré de façon satisfaisante.
Un des points clés du mécanisme de sélection IF3-dépendante de l’ARNtMet f est la présence des trois paires G C consécutives, retrouvées dans la tige an- ticodon de tous les ARNt initiateurs [12, 433, 434]. Cette caractéristique de séquence est nécessaire, en présence des facteurs d’initiation, à la fixation de l’ARNtMet
f au site P de la sous-unité 30S in vitro [122]. Elle est aussi indis- pensable pour l’initiation de la traduction in vivo [446]. Il a aussi été montré par des expériences de mutagénèse, que la sélection IF3-dépendante de tiges- boucles anticodons ne nécessitait pas seulement ces paires G C caractéristiques des initiateurs, mais également la séquence inchangée de la boucle anticodon [123]. De façon très intéressante, ces mêmes expériences de mutagénèse ont montré que la sélection IF3-dépendante d’un ARNt en tant qu’ARNt initia- teur était corrélée à sa moindre sensibilité vis-à-vis de la nucléase S1 [123]. En effet, des mutations dans la tige ou dans la boucle anticodon de l’ARNtMet
abolissent de façon concomitante sa capacité à initier la synthèse protéique et son profil particulier de clivage à la nucléase S1 [122, 123] (voir Figure 9.3 pour les profils de clivages à la nucléase S1). Ceci suggère très fortement que la conformation particulière de la tige-boucle anticodon des ARNt initia- teurs (Paragraphe 9.2.2) soit nécessaire à leur fonction initiatrice, et cela au travers d’une sélection IF3-dépendante de cette conformation au sein du site P. Cependant, une étude menée par l’équipe de Uttam RajBhandary semble en contradiction avec cette affirmation. En effet, ils ont montré qu’un ARNt suppresseur pouvait servir d’ARNt initiateur sur le codon de terminaison UAG [465]. Et bien que les trois paires G C de la tige soient indispensables à son ac- tivité initiatrice, la boucle anticodon de cet ARNt ne présente pas de résistance particulière à la nucléase S1. De plus, son profil de clivage est inchangé lorsque des mutations qui abolissent sa sélection en tant qu’ARNt initiateur sont in- troduites dans la tige [446]. Ceci suggère donc que la conformation particulière de la tige-boucle anticodon — qui trouve vraisemblablement son origine dans les trois paires G C de la tige et dans la séquence particulière de la boucle — ne soit pas un déterminant de sélection des ARNt initiateurs, mais que seule la présence des trois paires G C soit requise et que celles-ci soient directement reconnues au niveau du site P du ribosome — soit par le ribosome lui-même, soit par le facteur IF3. Cependant, comme le font remarquer les auteurs, le fait que l’ARNt suppresseur construit présente un profil de clivage à la nucléase S1 différent de celui des ARNt initiateurs, mais qu’il puisse tout de même ini- tier la synthèse protéique pourrait également s’expliquer si l’on considère que celui-ci est impliqué dans un équilibre conformationnel, entre la conformation de l’ARNtMet
f — qui lui confère par là son activité initiatrice — et celle des ARNt élongateurs — qui lui donne ainsi ce profil de digestion à la nucléase S1 [446]. En effet, si l’on admet une interconversion possible entre la conforma- tion « initiateur » et la conformation « élongateur » au sein des tiges boucles anticodons, cet équilibre conformationnel pourrait être déplacé, dans le cas de l’ARNt suppresseur de cette étude, en faveur de celle des ARNt élongateurs par une simple modification de la séquence de la boucle. Mais la modification de séquence étant tout de même assez minime, une certaine proportion d’ARNt suppresseur pourrait présenter la conformation « initiateur » de l’anticodon et ainsi permettre l’initiation de la synthèse protéique. De façon intéressante, un équilibre conformationnel de la tige-boucle anticodon de l’ARNtMet
f a été
observé par RMN, mais sa nature exacte n’a pas été déterminée [445].
En résumé, il n’est ainsi pas absolument certain que la conformation par- ticulière des tiges-boucles anticodon des ARNt initiateurs soit nécessaire à leur fonction initiatrice. Ainsi, les trois paires G C requises pour la fonction initiatrice des ARNt doivent être directement reconnues au niveau du site P du ribosome — soit par le ribosome lui-même, soit par le facteur IF3. Les structures des complexes 70S–ARNtMet
f [46, 47, 455] ont donné une explication structurale quant au rôle de deux des paires G C de la tige. En effet, deux d’entre elles sont impliquées dans des interactions de type A-mineur avec les
9.4. La sélection IF3-dépendante de l’ARNt initiateur 153 nucléotides G1338 et A1339 de l’ARNr 16S (Paragraphe 9.3.2 et Figure 9.5). L’implication de ces nucléotides du site P dans la sélection IF3 dépendante de l’ARNt initiateur a de plus été montré par des expériences de mutagénèse [460].
Cependant, le fait que la sélection de l’ARNt initiateur ne puisse pas s’ef- fectuer en l’absence du facteur d’initiation IF3 a amené à formuler l’hypothèse que sous l’effet d’un changement conformationnel induit par IF3, les bases G1338 et A1339 venaient vérifier l’identité de l’ARNt présent au site P grâce à ces interactions A-mineur [459]. Le fait que l’interaction A-mineur entre la base A1339 et la paire G30 C40ne soit pas optimale dans la structure du ribo- some 70S (Figure 9.5) va également dans ce sens, puisque durant l’initiation, de petits mouvements de la « tête » de la petite sous-unité pourraient per- mettre d’obtenir une géométrie optimale afin d’inspecter le petit sillon de la tige anticodon de l’ARNt présent au site P [47].
Il aurait également été possible que le facteur IF3 intervienne en recon- naissant directement les paires G C de la tige anticodon de l’ARNt initiateur, mais au regard de la connaissance que l’on a de la position de IF3 sur la petite sous-unité [459, 463], celui-ci semble trop éloigné de cette région de l’anticodon pour pouvoir réaliser la vérification par lui-même.
Toutes ses données semblent bien expliquer le rôle des paires G C, celui des nucléotides G1338 et A1339, et celui du facteur IF3. Cependant, quelques zones d’ombres subsistent concernant ce mécanisme de décodage IF3-dépendant. En effet, si seules les deux interactions A-mineur avec les paires G29 C41 et G30 C40étaient requises pour la sélection de l’ARNt initiateur, certains ARNt présentant deux paires G C (G29 C41 et G30 C40) dans leur tige anticodon devraient être plus résistants à l’éjection du site P par IF3 [460]. De plus, ce modèle n’explique pas le rôle joué par la troisième paire G C (G31 C39). D’autre part, si seules les deux interactions A-mineur étaient requises, des mu- tants de la sous-unité 30S aux positions 1338 et 1339 devraient, en présence du facteur IF3, éjecter tous les ARNt du site P, y compris l’ARNtMet
f . Ceci a été observé à de fortes concentrations d’IF3, mais le comportement du site P à de faibles concentrations d’IF3 suggère qu’il existe une interaction additionnelle, spécifique de la région de l’anticodon de l’ARNtMet
f , qui favorise sa fixation au sein du site P [460]. La nature de cette interaction additionnelle n’a cependant toujours pas été identifiée.
Chapitre 10
Une structure unique de
l’anticodon de l’ARNt
Metf
d’E. coli
10.1
Problématique et résumé de l’Article 4
D’un point de vue structural, la conformation particulière de la tige-boucle anticodon des ARNt initiateurs — révélée par des tests enzymatiques de cli- vage à la nucléase S1 et par sondes chimiques en solution — reste à l’heure actuelle inexpliquée. Lors d’essais de co-cristallisation de la m1A
58 MTase de
T. thermophilus avec l’ARNtMet
f d’E. coli, nous avons obtenu des cristaux de l’ARNtMet
f seul, qui nous ont permis de résoudre la structure de cet ARNt ini- tiateur. La diffraction des cristaux d’ARNtMet
f s’est révélée être très anisotrope. Cependant, le traitement attentif de cette anisotropie nous a permis d’obtenir des cartes de densité très bien définies, et ce également pour la région de l’an- ticodon. L’ARNtMet
f adopte la structure classique en forme de « L » des ARNt. Cependant, la région de l’anticodon révèle une structure unique impliquant directement deux des trois paires G C de l’anticodon. Cette structure permet d’expliquer de nombreuses données biochimiques de la littérature. Elle peut être décrite par trois éléments particuliers :
– Une paire de base Cm32✏❨✏A38de type wobble qui étend la tige anticodon d’une paire supplémentaire
– Une base triple entre la base A37située juste après le triplet de l’anticodon et la paire G29 C41 dans le grand sillon de la tige anticodon
– Un empilement particulier des bases de la boucle anticodon, où la base A38 est directement empilée sur la dernière base de l’anticodon (U36), alors qu’elle est empilée sur la base 37 dans toutes les structures d’ARNt élongateurs
Cette structure particulière de la région de l’anticodon de l’ARNtMet
f est
représentée en vue stéréoscopique à la Figure 10.1.
Figure 10.1 – Structure unique de l’anticodon de l’ARNtMet f
Vue stéréoscopique de l’anticodon de l’ARNtMet
f . Les nucléotides de la tige sont en
bleu foncé, la paire de base Cm32✏❨✏A38de type wobble est en vert, et les nucléotides
de la boucle sont en rouge. La base A37 vient interagir avec la paire G29 C41 dans
le grand sillon de la tige anticodon.
Cette structure unique pourrait permettre une interaction additionnelle dis- criminante entre la région de l’anticodon de l’ARNt initiateur et la machinerie de traduction au niveau du site P du ribosome — soit de manière directe, soit par l’intermédiaire d’IF3, et ainsi être un élément crucial — en plus des paires G C impliquées dans les interactions A-mineur — permettant la sélection de l’ARNt initiateur lors de l’initiation de la traduction.