La protéine Iff11 : une Iff secrétée

La protéine Iff11 a été étudiée pour la première fois par (Bates et al., 2007), en utilisant deux souches, interrompant ou surexprimant IFF11. Le mutant iff11-/- a été réalisé par interruption de IFF11 dans la souche CAI-4 par la méthode Ura Blaster, suivie de la réintégration du gène URA3 au locus RPS10. La souche de surexpression exprime le gène

IFF11 sous le contrôle du promoteur de l’enolase ENO1 et comprend un tag V5. Cette

dernière souche a permis de localiser Iff11-V5 dans la fraction secrétée par Western blot. Cela n’exclut pas le fait qu’il y aurait quelques protéines en quantité indétectable présentes dans la paroi. La détection d’Iff11-V5 dans une souche exprimant le gène sous son propre promoteur n’a pas été possible. Cela montre que le gène IFF11 est très peu exprimé dans les conditions de culture de laboratoire. Le mutant iff11-/- a montré un retard de filamentation sur milieu spider, ainsi qu’une hypersensibilité en milieu liquide contenant soit du Calcofluor White, soit du SDS, soit du Rouge Congo. Ces défauts de paroi sont plutôt inattendus puisqu’Iff11 est la

seule protéine Iff qui soit secrétée. Le mutant a par ailleurs montré une virulence atténuée dans un modèle murin d’infection systémique, bien que l’invasion tissulaire soit restée comparable à celle d’une souche sauvage. Comme Iff4, cette protéine ne semblerait donc pas nécessaire une fois l’infection établie, mais plutôt lors des étapes initiant l’infection.

Projet de recherche

C. albicans est un pathogène très bien adapté à son environnement variable en terme par

exemple de pH, température, potentiel redox ou d’agents enzymatiques divers (phagosomes), ce qui implique qu’au cours de son évolution il ait développé des mécanismes originaux pour coloniser son hôte. Ces fonctions originales pourraient éventuellement être portées par une ou plusieurs protéines de fonction inconnues. Les données sur le génome de C. albicans nous ont permis d’identifier un grand nombre de protéines à ancre GPI, pour la plupart de fonction inconnue et absentes chez la levure non pathogène S. cerevisiae. Leur localisation en surface leur confère potentiellement une place privilégiée pour interagir avec l’environnement et la cellule hôte. Dans l’introduction, j’ai rappelé que des protéines à ancre GPI avaient déjà été identifiées comme étant des facteurs de virulence (biogenèse de la paroi, formation de l’hyphe, adhésion et formation du biofilm, virulence et interaction avec le système immunitaire, …).

Dans cette étude nous nous sommes intéressés à la plus grande famille de protéines à ancre GPI. Comme montré dans l’introduction, seules 3 protéines sur les 12 membres composant cette famille ont fait l’objet de publications depuis 1996. Deux de ces protéines sont importantes dans l’adhérence et dans la virulence en modèle d’infection systémique. Cette famille nous a donc paru intéressante.

Mon objectif premier était donc d’obtenir une banque complète de mutants iff-/-. Dans un second temps, j’ai voulu réaliser un criblage de ces mutants dans divers modèles cellulaires ou animaux pour identifier de nouvelles protéines impliquées dans l’interaction avec l’hôte.

II Matériel et méthodes

1 Matériel

1.1-Matériel biologique

1.1.1-Les souches des différents microorganismes utilisés

La première étape de mon travail consistait en la construction des mutants iff-/-, ces derniers sont décrits dans la partie Résultats (3.1). Le tableau 2 liste les souches obtenues d’autres laboratoires et qui ont été utilisées dans le cadre de ce travail.

Souches Souche

parentale Description Référence

Escherichia coli

Top10 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ-

Invitrogen

Candida albicans SC5314 Isolat

clinique

Souche sauvage de Candida albicans (Gillum et al., 1984) CAI4 iro-ura3Δ::λimm434/iro-ura3Δ::λimm434

BWP17 CAI4 iro-ura3Δ::λimm434/iro-ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::hisG (Wilson et al., 1999) DAY286 BWP17 iro-ura3Δ::λimm434/iro-ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG pARG4::URA3::arg4::hisG/arg4::hisG (Davis et al., 2002) CAI4+CIp10 CAI4 iro-ura3Δ::λimm434/iro-ura3Δ::λimm434,

RPS10::CIp10-URA3

(Hobson et al., 2004) 1843 (als3-/-) 1779 iro-ura3Δ::λimm434/iro-ura3Δ::λimm434

als3laΔ/als3saΔ-URA3

(Zhao et al., 2004) 2322 (als3/ALS3) 2311 iro-ura3Δ::λimm434/iro-ura3Δ::λimm434

als3laΔ/als3saΔ-ALS3LA-URA3

(Zhao et al., 2006) hyr1-/- CAI4 ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434

hyr1::hisG/hyr1::hisG-URA3-hisG

(Bailey et al., 1996) Tableau 2 : Souches utilisées dans cette étude

La souche de levure utilisée pour la construction des mutants est la souche BWP17

ura3::imm434/ura3::imm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::hisG. Celle-ci est issue

de BWP17, elle même dérivée par quatre transformations de l’isolat clinique SC5314 (Wilson

et al., 1999).

Pour les clonages plasmidiques nous avons utilisé la souche E. coli Top10 F-, mcrA,

(mrr-hsdRMS-mcrBC), 80lacZM15, lacX74, recA1, ara139, (ara-leu) 7697, galU, galK, rpsL, (StrR,) endA1, nupG (Stratagene, CA).

1.1.2-Les cellules de mammifères

Les macrophages

La lignée cellulaire utilisée, J774.2, est issue d’une tumeur de souris BALB/c. Comme les macrophages humains, ce sont des cellules fortement motiles capables de chimiotaxie et de phagocytose (Lam et al., 2009). Cependant elles n’expriment pas le récepteur spécifique du mannose (Fiani et al., 1998).

Les cellules épithéliales vaginales

La lignée cellulaire utilisée, HeLa, est issue d’un prélèvement de métastase effectué sur une patiente atteinte d’un cancer du col de l’utérus. Elle a été fournie par le laboratoire Sigma en relation avec l’ECACC (European Collection of Cell Culture).

1.2-Les enzymes

Les enzymes de restrictions ont été achetées chez New England Biolabs (Madison, USA). Pour les PCR, différentes enzymes ont été utilisées en fonction de ce à quoi était destiné le produit de PCR :

- pour le clonage : Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) - pour les autres PCR : GoTaq® DNA polymérase (Promega).

1.3-Les solutions

Solutions pour les E. coli compétentes :

-Milieu φB : 5g/l de Bacto YE

20g/l de Bacto Tryptone ajuster à pH 7,6 avec du KOH

+ 14g/l de Bacto Agar (Difco)

Au moment de l’utiliser, ajouter du MgSO4 à 5g/l final

-Milieu φA : milieu φB sans agar

-RF1 : 30 mM potassium acétate 100 mM RbCl2

10 mM CaCl2 50 mM MnCl2

+ glycérol 15% final (volume/volume) Ajuster le pH à 5,8 avec 0,2 M d’acide acétique

-RF2 : 10 mM MOPS 75 mM CaCl2 10 mM RbCl2

+ glycérol 15% final (v/v) Ajuster le pH à 6,5 avec du KOH

RF1 et RF2 seront stérilisés par filtrage et conservés à 4°C.

Tampon d’hybridation pour Southern blot :

Tampon Denhardt 50X (Ficoll400 1%, BSA 1%, polyvinylpyrrolidone 1%) : 5 ml SSC 20X : 15 ml

SDS 20% : 1,25ml ssDNA 10 µg/µl : 500 µl H2O : qsp 50 ml

1.4-Milieux de culture

Milieu de culture complet pour E. coli : LB

-10 g/l bacto tryptone, -5 g/l extrait de levure, -10 g/l NaCl

De l’ampicilline a été ajouté en fonction des plasmides utilisés à une concentration de 100 µg/ml.

Milieu complet de croissance des levures : YPD

-10 g/l bacto peptone, -5 g/l extrait de levure, -10 g/l glucose.

Milieu minimum de croissance et de sélection des transformants de C. albicans : SC

-1.7 g/l YNB (Yeast Nitrogen Base) sans sulfate d’ammonium ni acides aminés, -5 g/l sulfate d’ammonium,

-20 g/l glucose.

Mélange d’acides aminés sans histidine, uridine, arginine utilisé pour le SC (décrit ci- dessus):

-0.5 g adénine,

-2 g inositol, proline, alanine, isoleucine, serine, cystéine, thréonine, glutamine, lysine, tryptophane, glycine, méthionine, tyrosine, phénylalanine, valine,

-10 g leucine.

Suppléments pour complémentation d’auxotrophie (concentrations finales) :

-uridine 50 mg/l, -histidine 2 mg/l, -arginine 4 mg/l.

Milieux inducteurs de filamentation chez C. albicans :

Tous les milieux ont été complémentés en Agar 20g/l pour les milieu solide.

- milieu Spider (1% « nutrient broth » (Difco, MD, Etats-Unis), 1% mannitol, 0.2% K2HPO4), - milieu serum (5% de serum de veau fœtal, eau).

- milieu de Lee : -5 g (NH4)2SO4 -0,2 g MgSO4 7H20

-5 g NaCl -12,5 g glucose

-acides aminés (0,5 g alanine, 1,3 g leucine, 1 g lysine, 0,1 g méthionine, 0,0714 g ornithine, 0,5 g phénylalanine, 0,5 g proline, 0,5 g thréonine, 0, 001 g biotine (filtrée) dans 1 l d’H20)

Milieu de culture de cellules mammifères :

- Les macrophages J774 sont cultivés en flacon de 75 cm2 dans un milieu D10 composé de DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) + GlutaMAXTM supplémenté de 10% de serum de veau fœtal (Gibco), 100 µg/ml de streptomycine – pénicilline.

- Les cellules HeLa sont cultivées en flacon de 75 cm2 dans un milieu H10 composé de DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) supplémenté de 10% de serum de veau fœtal (Gibco), de 100mM d’acides aminés non essentiels, de 100 µg/ml de streptomycine et 100µg /ml de pénicilline.

Milieux de conservation :

- les microorganismes sont conservés à -80°C dans du YPD + 25% glycérol.

- les cellules HeLa sont conservées dans leur milieu de culture + 20% DMSO et les macrophages J774 sont conservés dans leur milieu de culture. Les cellules sont congelées d’abord à -80°C un jour puis sont transférées dans l’azote liquide.

2 Méthodes