Le premier gène étudié : HYR1

Le gène HYR1 fut le premier gène de la famille IFF à être étudié (Bailey et al., 1996). Bailey et al. ont trouvé par des analyses de Northern blot que l’ARNm de HYR1 était induit spécifiquement en réponse au développement de l’hyphe, lorsque la morphogenèse était stimulée indépendamment des conditions du milieu (soit par l’addition de sérum et une

élévation de température, soit en augmentant à la fois le pH et la température, soit en ajoutant de la N-acétylglucosamine). C’est aussi le cas des gènes ECE1 qui code une protéine intracellulaire non essentielle (Birse et al., 1993) et HWP1 qui code une protéine de surface spécifique de l’hyphe (Staab et al., 1996). D’autres gènes sont induits durant le développement de l’hyphe mais seulement sous certaines conditions. C’est le cas des gènes

PHR1 (gène régulé par la réponse au pH) (Saporito-Irwin et al., 1995), SAP2, SAP4, SAP5 et SAP6 (gènes induits par le sérum, codant une aspartyl protéinase) (Hube et al., 1994) et enfin ALS1 (induit en milieu RPMI) (Hoyer et al., 1995). De nombreux autres gènes sont également

induits dans ces conditions. Ils codent des fonctions variées telle que la glycolyse (ADH), la synthèse et le repliement protéique (TEF3, RP10) (Swoboda et al., 1994a; Swoboda et al., 1994b), la biosynthèse de la paroi ou la formation du cytosquelette (ACT1) (Delbruck & Ernst, 1993; Swoboda et al., 1994a). En fait, si on a montré que quelques protéines de surface étaient exprimées différemment selon les conditions du milieu et selon la morphologie de la levure, ces études ont aussi montré qu’une petite fraction seulement de ces protéines étaient forme-spécifiques (Finney et al., 1985).

Le mutant knock-out de HYR1 a été réalisé par URA-Blaster et n’a pas de phénotype particulier (Bailey et al., 1996). Il pousse normalement sur milieu à la caféine ou au calcofluor, la croissance des levures et des hyphes est normale et la cinétique des tubes germinatifs n’est pas non plus affectée. N’ayant observé aucun phénotype du mutant, ils ont changé de stratégie. L’expression forcée de HYR1 dans la forme levure par une fusion ADH1-

HYR1 dans CAI4 n’a affecté ni la croissance, ni la morphologie de C. albicans. L’expression

aberrante de HYR1 ne stimule pas la formation de l’hyphe, ni la croissance pseudo hyphale chez S. cerevisiae. Chez C. albicans, HYR1 a été récemment impliqué dans la résistance aux défenses de l’hôte. Il accroît l’action candidacide des macrophages in vitro et réduit la charge rénale des souris infectées ( Luo et al., 2010). En accord avec ces observations, ces derniers

auteurs ont montré qu’un anticorps polyclonal anti-Hyr1 accroît l’activité candidacide des neutrophiles in vitro et que la vaccination de souris avec Hyr1 les protégeait efficacement contre une candidose dans un modèle d’infection disséminée.

4 4.2 Etude par surexpression ou inactivation d’un gène IFF

Afin d’identifier de nouveaux gènes de virulence, Fu et collaborateurs ont construit des souches de surexpression/inactivation des gènes HYR1, IFF2, IFF3 et IFF4. Un des allèles de ces gènes a été placé sous le contrôle d’un promoteur induit en absence de doxycycline dans le milieu, l’autre allèle ayant été invalidé (Fu et al., 2002).

Une expérience combinant la cytométrie en flux et l’immunofluorescence a montré que dans ces mutants en condition de surexpression (sans doxycycline) ou de répression (avec doxycycline), l’accumulation de la protéine Als1 à la surface restait constante. Il n’y a donc pas de régulation croisée entre la protéine Als1 et les gènes IFF étudiés.

L’adhésion sur tube de plastique a également été testée en condition de surexpression et de répression. Seule la souche surexprimant IFF4 a montré une plus grande adhérence sur plastique. La suite des expériences a donc été ciblée sur ce gène, et pour cela l’allèle sauvage

IFF4 a lui aussi été placé sous le contrôle du promoteur tetR. Pour éviter les artéfacts dus à

une mauvaise expression du gène URA3, ce gène a été replacé à son locus originel. La surexpression du gène IFF4 entraîne une meilleure adhérence sur cellules épithéliales orale FaDu, alors que l’inactivation du gène IFF4 entraîne une chute d’adhérence comparée à la souche témoin. Par contre, la surexpression ou l’inactivation du gène IFF4 ne semblent affecter ni l’adhérence ni la destruction quand les souches sont testées sur cellules endothéliales. Le phénotype d’adhésion suite à la surexpression du gène IFF4 semble avoir une incidence sur l’invasion d’un modèle in vivo de candidose vaginale chez la souris. La souche surexprimant IFF4 est plus sensible aux neutrophiles et est moins virulente dans un

modèle in vivo de souris immunocompétente. Par ailleurs, les reins de la souris infectée sont significativement moins envahis par la levure. Cet effet n’est pas observé chez les souris neutropéniques. Au vu de ces expériences, il semblerait donc que le gène IFF4 ne doive pas être exprimée pendant la phase de dissémination hématogène de C. albicans pour que l’invasion des tissus soit efficace.

M. Kempf (Kempf et al., 2007) a elle aussi étudié la fonction de la protéine Iff4 en construisant un mutant Knock out. Ce mutant a été construit par la méthode d’intégration par double recombinaison homologue avec des produits de PCR. Ce mutant a montré une petite diminution de l’adhérence sur polystyrène, ainsi qu’une diminution de la mobilité électrophorétique de ses tubes germinatifs. Cette différence a été attribuée à une organisation structurale différente des mannoprotéines pariétales du mutant iff4-/- et du sauvage. Néanmoins le processus d’adhérence est complexe et implique de nombreux phénomènes biologiques et biophysiques. C’est pourquoi l’étude a été poursuivie en montrant que le mutant adhérait également moins bien sur cathéter de silicone. Par ailleurs, ce mutant est moins virulent dans un modèle murin de candidose disséminée par rapport à la souche parentale BWP17. Etonnamment, si la virulence était fortement diminuée, l’aptitude à envahir les tissus restait inchangée et la charge rénale en levures était la même pour les deux souches.

Les études de Kempf et al. et Fu et al. ont montré de façon contradictoire que l’inactivation ou la surexpression de IFF4 affectaient toutes deux l’infection disséminée dans un modèle souris. Cela pourrait s’expliquer par le fait que la souche surexprimant IFF4 est plus sensible aux neutrophiles et envahit moins facilement les tissus lors d’une infection disséminée, tandis que les souches invalidées pour IFF4 sont affectées à une étape précoce de colonisation des tissus mais restent capables de les envahir quand elles sont installées. On notera aussi que les résultats obtenus sur les souches délétées pour IFF4 ne sont pas

d’IFF4, tandis qu’une expression résiduelle en présence de doxycline reste possible dans les souches utilisées par Fu et al.. Nous verrons que nous avons été confrontés à ce problème dans la partie Résultats. Le travail de Kempf et al. souligne par ailleurs que la surexpression d’une protéine peut incidemment affecter l’expression d’autres protéines pariétales ce qui amènerait à un phénotype qui ne serait pas lié à la protéine étudiée. Les études sur IFF4 ont montré que son expression était dépendante du contexte anatomique et du modèle d’infection disséminée utilisé. Iff4 serait impliquée directement ou indirectement dans l’infection par sa capacité à adhérer et donc à coloniser le matériel biologique. Il reste à tester l’adhérence sur des matériaux de nature chimique différente tels que le latex ou le polyuréthane et il serait bien de tester également la virulence dans un autre modèle comme un modèle de cathéter central chez le rat.