3.2: Protéine HBc et capsides

Egalement appelé P21, cette protéine est codée par l’ORF C. Elle est traduite de l’ARNpg. C’est une protéine de 21.5 kDa qui selon les génotypes est composée de 183 à 185 a.a. Elle est très conservée d’un génotype à l’autre. La localisation subcellulaire de HBc est variable, elle est détectée dans le cytoplasme mais également dans le noyau (Li et al 2010).

Figure 21 : Protéine HBc du VHB

Représentation schématique de la protéine HBc HBV : ARD : Arginin Rich Domain, NLS : Nuclear Localization Signal. Adapté de (Li et al 2010).

Comme on peut le voir sur la figure 21, la protéine est composée de deux domaines. Le domaine N-ter s’étend des résidus 1 à 149 (151 en fonction du génotype). Les 149 premiers a.a. sont suffisants pour permettre l’homodimérisation. Le domaine C-ter est constitué des 34 derniers a.a. Ce domaine comprend quatre domaines riches en arginine : domaine ARD (Arginin Rich Domain) et également un signal de localisation nucléaire (NLS) (Kann et al 1999). Structuralement, le domaine C-ter est flexible, il est à l’intérieur de la capside en présence d’ARNpg, mais lorsque les

65 capsides contiennent un génome mature (ADNrc) la partie C-terminal incluant le NLS devient exposée à l’extérieur de la capside.

La capside

Le domaine N-ter de la protéine HBc est également appelé domaine d’assemblage. En effet, ce domaine à lui seul permet la formation de capsides. Cette protéine est hélicoïdale (Crowther et al 1994; Wingfield et al 1995; Bottcher et al 1997).

Figure 22 : Structures cristallographiques du monomère de HBc, du dimère et de la capside

A représentation des cinq hélices alpha du monomère de HBc. Sont identifiés sur la figure les hélices alpha 3 et 4. B dimère de monomère de HBc (bleu et rouge) les hélices alpha 3 et 4 forment la pointe immunogénique. En vert sont identifiées les cystéines 61 impliquées dans la formation d’un pont dissulfure interchaîne, en jaune sont identifiées les cystéines 48. C : capside entière de symétrie T4 où les monomères sont de couleur bleue, rouge, verte et jaune. Adapté de (Wynne et al 1999).

Les cinq hélices alpha s’organisent en structure antiparallèle et forment une pointe entre les hélices trois et quatre. Ces deux hélices constituant une surface très hydrophobe, elles favorisent leur dimérisation en formant des groupes de quatre hélices (Figure 22). Des ponts disulfures inter-chaîne ont été identifiés. Un via la cystéine 61 qui se forme à l’interface du dimère (Zhou and Standring 1992). Ce pont disulfure joue un rôle majeur dans la stabilité des capsides (Selzer et al 2014). Un autre pont disulfure impliquant la cystéine 183 a été identifié après expression de HBc dans des cellules eucaryotes (formation de pont disulfure entre les deux cystéines 183 d’un dimère de HBc) et dans des bactéries (formation de pont disulfure entre les cystéines 183 de différents dimères de HBc) (Seifer and Standring 1994). Trois dimères s’associent pour former des hexamères de HBc qui s’assemblent pour former la capside. La capside dont la taille a été déterminée en cryomicroscopie électronique mesure 36 nm et a une structure icosahédrique. Deux structures différentes ont été observées en microscopie électronique et en cryomicroscopie

66 provenant de capsides assemblées in vivo et in vitro (Cohen and Richmond 1982; Crowther et al 1994; Conway et al 1997):

 La forme minoritaire : forme T3 est composée de 180 monomères de HBc pour un diamètre de 32 nm

 La forme majoritaire : forme T4, qui représente 80 à 90% des capsides, est composée de 240 monomères de HBc pour un diamètre de 36 nm

Ces structures ont à leur surface des pores de 1,3 nm permettant la diffusion de petites molécules comme les nucléotides.

La capside dans le cycle de réplication du virus

La capside via les résidus 76 et 82 de HBc interagit avec le domaine preS1 de la protéine de surface L du VHB (Bruss 1997). Dans les étapes précoces de l’infection, la capside permet le transport du génome jusqu’au noyau des cellules hépatiques (Rabe et al 2006). Le génome est ainsi protégé des réponses cellulaires (TLR : Toll Like Receptor). La séquence NLS présente dans le domaine C-ter de HBc permet le transport des capsides jusqu’au panier nucléaire du NPC.

Plus tardivement dans le cycle de réplication du virus, ce domaine C-ter est important pour la maturation du génome qui va passer de la forme ARNpg à ADNrc (voir X.8 : retrotranscription de l’ARNpg). Ce mécanisme se déroule exclusivement dans la capside.

Plusieurs sérines peuvent potentiellement être phosphorylées. Le laboratoire a montré l’implication la Protéine Kinase C (PKC) dans la phosphorylation de HBc (Wittkop et al 2010). D’autres protéines kinases phosphorylent la protéine HBc : SRPK 1 et 2 (Serine/Arginine protein specific kinase 1 et 2) (Daub et al 2002), cdc2/cdk2 (cyclin dependant protein kinase) (Yeh et al 1993; Ludgate et al 2012) et une sérine kinase de 46 kDa (Kau and Ting 1998). De récents travaux montrent que l’état de phosphorylation de HBc est dépendant des protéines qui interagissent avec HBc (Ludgate et al 2011). Le rôle des phosphorylations est important dans plusieurs étapes du cycle de réplication du virus :

 L’import nucléaire (Kann et al 2007).

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 La réplication du génome (Gazina et al 2000; Basagoudanavar et al 2007). La phosphorylation de la sérine 172 est requise pour la synthèse du brin positif de l’ADNrc (Lan et al 1999).

Cependant l’état de phosphorylation des capsides in vivo est très mal connu. Au regard des protéines kinases hypothétiquement impliquées, la compréhension des mécanismes cellulaires et viraux dépendant de ces phosphorylations est compliquée.

Les capsides recombinantes

La protéine HBc a été exprimée dans les cellules de différents organismes, bactéries (Burrell et al 1979; Stahl et al 1982), levures (Rolland et al 2001), cellules d’insecte (Seifer et al 1998), cellules de mammifères et des ovocyte de Xenopus laevis (Seifer et al 1993) (travaux non publiés de nos collaborateurs P Pumpens, Riga) et à chaque fois l’expression hétérologue de la protéine HBc a conduit, de par ses propriétés d’assemblage, à la production de capsides dans ces cellules. Systématiquement, lors de leur assemblage, de l’ARN messager cellulaire se retrouve encapsidé « au hasard ». Des capsides peuvent également s’assembler in vitro (Ceres and Zlotnick 2002) cependant l’ARN accelère l’assemblage (Rabe et al 2009). Les capsides surexprimées chez la levure sont phosphorylées par une kinase endogène (Freivalds et al 2011) et acétylées (Watelet et al 2002). Des capsides ont également été produites et purifiées à partir de cellules d’insecte. Les capsides produites à partir d’E.coli et de P.pastoris sont purifiées par centrifugation sur gradient de saccharose suivie d’une chromatographie d’exclusion de taille. Des observations en microscopie électronique à partir des capsides recombinantes ont permis d’observer des capsides T3 et T4 (Crowther et al 1994). Cependant il semblerait que la vitesse d’assemblage influence les proportions des deux symétries. Des acides nucléiques (ARNm) sont encapsidés dans les deux types de capside. Ces capsides recombinantes ont permis des études structurales en cryoelectromicroscopie (CryoEM) et par cristallographie aux rayons X (Bottcher et al 1997; Conway et al 1997; Yu et al 2013). Des méthodes d’encapsidation de composés ont également été étudiées : une méthode d’encapsidation de la GFP a été mise au point (Lee and Tan 2008). Ces capsides recombinantes sont également utilisées pour la mise en place de tests diagnostiques pour la détection d’anticorps anti HBc dans les sérums de patients. (Li et al 2007)