Le promoteur et le terminateur ne semblent pas avoir un rôle aussi critique que la tige-boucle reconnue par Rnt1p.

Initialement, pour identifier l’existence ou l’absence de ce mécanisme, 15 gènes codant pour des ARNm substrats de Rnt1p furent testés afin d’identifier une variation de la polymérase lors de la suppression de Rnt1 (Table S1). Parmi les 15 gènes testés, seulement quatre ont démontrés une diminution significative et claire de l’ARN polymérase II après le site de clivage. En analysant les différents gènes de l’ensemble étudié, ceux qui possédaient les profils d’une terminaison prémature potentielle avaient tous un faible nombre de copie d’ARNm par cellule. À partir de cette observation, il nous semblait possible que le taux de transcription, sa vitesse ou le nombre d’unités de polymérase sur le gène soient responsables de la présence de ce mécanisme. Cette hypothèse était de plus appuyée par certaines études qui avaient démontré que la dégradation des ARNm pouvait être modulée par des mécanismes spécifiques à certains gènes via des séquences régulatrices dans la région promotrices (Dori-Bachash M et al, 2012) (Trcek T et al, 2011). Cela ressemblait un peu à notre situation, car dans une de ces études, il semblait y avoir moins de 100 gènes qui étaient régulés de manière promoteur spécifique selon un mécanisme encore mal compris (Dori-Bachash M et al, 2012).

Ainsi, l’hypothèse que le promoteur ait un rôle important dans la régulation du mécanisme de terminaison dépendant de Rnt1p fut émise. Pour répondre à cette question, nous avons donc échangé toute la séquence promotrice du gène DGR2 pour celui du gène

ACT1, un gène beaucoup plus fortement exprimé et non substrat de Rnt1p (Figure 5).

Cependant, bien que le niveau général d’expression du gène ait augmenté quantitativement, il fut toujours possible de voir une augmentation relative de la polymérase dans une souche

rnt1après le site de clivage. Ainsi, un changement de promoteur ne semblait pas apte à

inactiver le mécanisme de terminaison prémature de la transcription Rnt1p dépendant. Il faut remettre en perspective que toute modification empêchant la formation de la séquence de la structure tige-boucle faisait disparaitre cette augmentation différentielle entre les deux souches (Figure 3C). Simultanément, toute modification du domaine catalytique de Rnt1p empêchait aussi une diminution de l’association de la polymérase après le site de clivage

(Figure 3E). Ces résultats provenant de la tige-boucle semblaient donc proportionnellement beaucoup plus importants et influents que ceux provenant du changement de promoteur.

Après courte réflexion, ces résultats peuvent quand même être logiques lorsque l’on regarde comment Rnt1p s’associe à la chromatine. Lorsqu’on regarde le profil d’association de Rnt1p à la chromatine de la souche avec la modification du promoteur, il est possible de remarquer une accumulation progressive de l’enzyme tout au long de la transcription comme celle de la souche sauvage (Figure 5B). Cela nous permet donc de supposer que le recrutement de Rnt1p à la région promotrice serait promoteur indépendant car le changement de promoteur n’a pas influencé le niveau d’association ou son profil. Cependant, même si le recrutement semble se faire de manière indépendante, Rnt1p est capable d’avoir un effet ARN dépendant et promoteur dépendant sur l’expression de certains gènes in-vivo (Lavoie M et al, 2012). Si ce n’est pas par la liaison de l’enzyme, il se pourrait que notre mécanisme soit régulé par la présence d’un cofacteur potentiellement lié au décrochage de Rnt1p. Par double-hybride, nous savons que Rnt1p est apte à lier différents facteurs de transcription, élément qui renforcissait notre théorie initiale du rôle du promoteur. Cependant, Rnt1p est apte à lier un grand nombre de protéines et nous ignorons toujours si sa liaison potentielle avec les facteurs de transcription est directe ou le simple fruit d’un hasard indirect. Nos résultats semblent suggérer que ces interactions sont beaucoup plus indirectes qu’estimées initialement et ont un effet moindre sur la capacité de Rnt1p à induire une terminaison dans les séquences codantes.

Dans ce mémoire, les résultats obtenus ont montré que Rnt1p n’est pas capable de quitter le complexe transcriptionnel dans la souche avec le promoteur d’actine, contrairement à ce qu’elle fait normalement après le site de clivage (Figure 5B). Il semble donc que Rnt1p soit toujours capable de cliver l’ARNm en cours de synthèse du gène

DGR2 avec un promoteur d’actine mais qu’il ne peut plus quitter le complexe

transcriptionnel avec l’ARNm après le clivage. Nous n’avons cependant pas élaboré d’expérience avec cette souche pour démontrer cette éventualité de clivage. En effet, certaines problématiques se sont imposées lors de la planification d’une expérience pour répondre à cette question. En effet, il était difficile de démontrer l’existence d’un clivage in-vitro avec l’ARNm de DGR2. Une des méthodes les plus simples et les plus utilisée dans

le laboratoire est de faire un clivage avec incubation avec Rnt1p et de regarder l’état des ARNm par northern blot. Cependant, avec un gène exprimé en moyenne à environ 1,2 ARN par cellule, il était très difficile de voir correctement l’ARNm dans la souche sauvage et encore plus d’observer ses produits de dégradation. Nous avions donc pensé utiliser la méthode de primer extension pour compenser cette difficulté. Cependant, le résultat obtenu d’un clivage aurait quand même été scientifiquement discutable car nous n’aurions pas pu démontrer la différence entre un clivage in-vitro et un clivage in-vivo par Rnt1p. Le clivage in-vitro consiste à mettre en contact des extraits totaux d’ARNm prélevés dans une souche

rnt1avec l’enzyme en grande quantité. Cependant, ce clivage forcé n’est pas assurément

symbole de ce qui se passe dans la cellule, surtout lorsque nous voulons étudier un mécanisme possiblement coordonné par plusieurs autres acteurs. Et comme nous savons qu’un substrat n’est pas forcément un symbole de terminaison, avoir démontré le clivage n’aurait pas avancé notre compréhension du mécanisme. Cependant, avec recul, cela aurait été un bon contrôle à avoir.

Simultanément aux tests sur le promoteur, nous avons regardé l’influence du terminateur sur notre mécanisme étudié. Pour ce faire, nous avons remplacé la séquence du terminateur de DGR2 par la séquence d’un terminateur fort, celui du gène ADH1 (Figure 5C et 5D). Nous voulions déterminer si celui-ci pouvait participer au mécanisme de terminaison prématurée et contrôler sa manifestation. Cette mutation a eu un impact important sur l’accumulation de la polymérase à la fin du gène, ce qui était attendu. Cependant, la suppression de RNT1 a démontré une accumulation encore plus forte de la polymérase à la fin du gène dans cette même souche (Figure 5C). Ainsi, l’impact du terminateur semble distinct ou simplement additif sur notre mécanisme Rnt1p dépendant, il ne semble pas en est pas la cause. Ces résultats furent contre nos attentes initiales, mais elles tendent à démontrer encore plus l’importance de la région dédiée au clivage de l’ARNm par Rnt1p. Comme mentionné précédemment, même la modification des régions géniques autour de la tige-boucle n’ont pas suffi à inactiver le phénomène (Figure S4). Une étude plus approfondie des structures des tiges-boucles formées sera à faire pour comprendre les caractéristiques nécessaires à induire l’activation de ce mécanisme et/ou le recrutement de partenaires tel que rat1p (Figure S5).