Projet de diplôme EPHE SVT
3.
En 2008, le consortium LeishDrug (programme européen FP7) a été créé afin de développer une approche interdisciplinaire pour identifier le rôle des kinases associées à la virulence des amastigotes dans la leishmaniose.
Dans le cadre de ce programme, une méthode de criblage phénotypique innovante et biologiquement pertinente, appelée « High Content Analysis » (HCA), a été développée pour identifier de nouveaux composés leishmanicides. Contrairement aux tests de criblages actuels, le HCA mime les conditions réelles d’infection en utilisant des macrophages primaires de souris infectés par des amastigotes virulents d’une souche de L. amazonesis exprimant DsRed2 (Figure 16A). Lors du criblage HCA, l’effet leishmanicide d’un composé est visualisé par la disparition de la fluorescence rouge des parasites (DsRed2), et verte de la VP (Lysotracker green DND-26) qui est associée à la présence des parasites. Les composés actifs montrent une absence totale de fluorescence rouge et verte alors que les composés
faiblement actifs montrent une diminution de l’un ou l’autre. La toxicité d’un composé est visualisée en parallèle par la disparition de la fluorescence bleue (Hoechst 33342), témoin de la dégradation des noyaux des macrophages (Figure 16) (Aulner et al., 2013). Cette approche évolutive qui pourrait être utilisée à haut débit, semble être, aujourd’hui, la meilleure option de criblage phénotypique chez Leishmania.
Dans le cadre de ce programme européen, puis du projet ANR TransLeish, nous avons utilisé cette méthode de criblage phénotypique en utilisant les banques de composés CNRS-Roscoff et PKRC (environ 2500 composés) qui ciblent
préférentiellement les kinases. Ces criblages ont permis d’identifier 20 « hits » (composé non optimisé avec une activité leishmanicide) qui ont été ensuite reconfirmés par HCA. Parmi ces « hits », 3 familles de composés ont été identifiées :
Paullones, Bis-Indolylmaléimides et Vibrindoles.
Sur les conseils de nos collaborateurs chimistes, 24
nous avons finalement retenu la famille des Bis-Indolylmaléimides et des Vibrindoles pour une étude SAR. Pour la première famille, les études SAR sont en cours alors que pour la famille des Vibrindoles, 40 dérivés ont pu être générés à partir du composé ROSC004-A07. Ces dérivés ont été
criblés par HCA pour finalement identifier
5 analogues avec une activité similaire au ROSC004-A07. N’ayant pas pu identifier de composé avec une meilleure activité, nous avons décidé d’utiliser le composé ROSC004-A07 pour la déconvolution de cibles (Prina et al., en préparation). En parallèle, nous nous sommes également intéressés aux membres de la famille Caséine Kinase 1 (CK1) de Leishmania, qui ont été décrites comme étant des cibles thérapeutiques prometteuses, et plus particulièrement la Caséine Kinase 1 isoforme 2 (CK1.2) (LmjF.35.1010) (Allocco et al., 2006). En effet, cette kinase a été identifiée comme étant une exokinase capable de phosphoryler certaines protéines de la cellule hôte infectée, entrainant alors une action immunosuppressive (Silverman et al., 2008).
Dans le cadre du projet européen FP7 LeishDrug, nous avons utilisé une approche ciblée multidisciplinaire combinant des analyses bio-informatiques, biochimiques et pharmacologiques avec un test d'infection sur macrophages afin de caractériser et de définir si CK1.2 pouvait être considérée comme une cible thérapeutique. Cette approche a montré que la protéine recombinante et transgénique de CK1.2 pouvait phosphoryler des substrats spécifiques de CK1, et qu’elle était sensible à la température et aux inhibiteurs spécifiques de CK1 (Rachidi et al., 2014). Il a également été démontré que la réduction de l'activité de CK1.2 par D4476 (inhibiteur spécifique de CK1) bloque la croissance des promastigotes, compromet fortement la viabilité des amastigotes axéniques et diminue le nombre de parasites dans les macrophages infectés (Allocco et al., 2006; Rachidi et al., 2014). Donc, sans exclure totalement la possibilité de cibles secondaires du D4476, ces résultats soulignent le rôle potentiel de la CK1.2 dans la survie des parasites intracellulaires. De plus, des différences de structure et de profil d’inhibition entre CK1.2 de Leishmania et les kinases CK1 de mammifères ont été observées, et pourraient être exploitées pour le développement de
médicaments leishmanicides ciblant CK1.2 (Rachidi et al., 2014). Nous avons donc développé un criblage par test enzymatique qui a été utilisé sur environ 4000 composés ciblant les kinases. Soixante-quinze composés ont été identifiés avec une activité leishmanicide, mais après évaluation de la toxicité de ces composés sur des macrophages de souris et sur des lignées cellulaires humaines, seuls quatre composés ont pu être validés (PP2, 5'Iodotubercidin, NSC699479, Indirubin 42) (Durieu et al., 2016). Etant donné que le composé Indirubin 42 était le plus efficace et le moins toxique, nous avons réalisé une étude SAR qui a permis de générer 13 dérivés. Après criblage par test enzymatique et tests de toxicité, seul le composé Indirubin 1530 a été retenu et vient s’additionner aux quatre composés validés comme candidats à une déconvolution de cibles.
Ces deux approches de criblage ont permis d’identifier une dizaine de nouveaux composés : Certains ont été sélectionnés pour leur efficacité contre le parasite (criblages phénotypiques), mais leurs cibles restent encore inconnues, et d’autres ont été sélectionnés pour leur efficacité à inhiber la Caséine kinase 1.2 (criblages ciblés), mais leur spécificité pour celle-ci n’a pas encore été établie (cibles secondaires possibles). Aujourd’hui, ces composés pourraient être optimisés pour le développement de nouveaux médicaments leishmanicides, et il est crucial de pouvoir identifier les cibles primaires et/ou secondaires de ces composés afin de comprendre leurs mécanismes d’action.
Pour cela, mon projet consiste à développer une nouvelle stratégie de déconvolution de cibles adaptée à ces inhibiteurs de kinases. Dans un premier temps, je devrais identifier et mettre au point une méthode qui me permette de capturer un nombre significatif de kinases, et qui pourraient être mise en concurrence par nos composés afin d’identifier leurs cibles. Dans un deuxième temps, je devrais également développer une approche, utilisant la protéomique, qui nous permettrait de déterminer la spécificité de nos composés. Et finalement, je devrais appliquer cette stratégie de déconvolution de cibles à nos composés afin de déterminer leur spécificité et leurs cibles.
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I. Matériel
Tous les produits chimiques, de qualité analytique ou supérieure, ont été achetés chez Sigma-Aldrich, Life Technologie, VWR ou GE Healthcare Life Sciences. Les milieux de culture, de qualité certifiée pour la culture, i.e. stériles et testés pour les endotoxines, ont été achetés chez Gibco ou Sigma-Aldrich. Le pH des tampons a été mesuré à température ambiante.