Détermination de la spécificité des composés issus des criblages 4
4. Purification3. Liaison
4.2. Détermination de la spécificité de composés par 2D-DiGE composés par 2D-DiGE
La 2D-DiGE (Differential Gel Electrophoresis) est une technique d’analyse différentielle des protéines sur gel qui permet la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique (Pi) et de leur masse. Les échantillons protéiques à comparer sont marqués avec des fluorochromes différents possédant la même masse, mais ayant des longueurs
d’onde d’excitation et d’émission différentes (Cy2, Cy3, Cy5). Ainsi, deux échantillons marqués
avec des fluorochromes différents pourront être mélangés et séparés sur un même gel. Ensuite, l’acquisition d’images aux longueurs d'onde spécifiques de chaque fluorochrome permet d’obtenir des images, qui pourront être comparées en s’affranchissant des variations de migration entre gels, souvent observées lors d’analyses réalisées de manière conventionnelle. De plus, il est également possible d’utiliser un standard interne (mélange de tous les échantillons à analyser) qui permet de calculer les ratios d’abondance de chaque protéine sur un gel, et de normaliser ces ratios grâce à l’utilisation d’un logiciel d’analyse d’image dédié (ex : Progenesis Samespots). Donc, étant donné les limitations précédemment décrites pour la méthode en une dimension, j’ai décidé d’utiliser la technique 2D-DiGE afin de séparer les protéines de mes élutions en fonction de leur point isoélectrique et de leur masse. Cette méthode me permettra une meilleure séparation et visualisation des protéines, mais aussi de comparer directement l’essai et la compétition dans un même gel pour valider définitivement la classe de spécificité de nos composés.
4.2.1. Visualisation des protéines de liaison à l’ATP par 2D-DiGE
Comme premier test, j’ai réalisé une
chromatographie d’affinité à l’ATP (Essai simple), comme décrit précédemment, à partir de 1 mg d’extrait de protéines totales d’amastigotes axéniques (Résultats II.2.1). Puis, les protéines contenues dans l’élution, le surnageant et 40 µg d’extrait de protéines totales ont été précipitées avec le ReadyPrep™ 2-D Cleanup Kit et solubilisés dans 20 µl de tampon d’échantillon compatible 2-D (Matériel & méthodes II.2.10 ; Tableau III). Ensuite, les protéines respectivement de l’élution, du surnageant et de l’extrait total ont été marquées avec 1 µl de G-Dye300 (Cy5), G-Dye200 (Cy3) et
G-Dye100 (Cy2) fournis dans le Refraction-2DTM
Labelling Kit (DyeAGNOSTICS), en accord avec les instructions du fournisseur. Finalement, les protéines marquées ont été mélangées, puis séparées par focalisation isoélectrique sur un IPG Strip* pH 4-7 suivit d’une électrophorèse sur gel Novex NuPAGE 2D well (Matériel & méthodes II.2.10). Les signaux de fluorescence de chaque fluorochrome ont été acquis 55
Figure 31. Détermination de la spécificité de composés par 2D-DiGE : Preuve de principe
(A) Un extrait total de protéines d’amastigotes axéniques a été soumis à une chromatographie d’affinité à l’ATP avec ou
sans compétition préalable (D4476 et 5’Iodotubercidin), puis les élutions ont été soumises à un 2D-DiGE. Les images ont été traitées avec le logiciel ImageJ afin d’ajuster l’intensité du signal entre les gels. (B, C, D) Superpositions des images de
(A). Les couleurs rouge et verte sont arbitraires mais nécessaires pour la superposition afin de pouvoir révéler les protéines communes (jaune) aux deux échantillons comparés.
B
C
D
A
Essa i (C y2 ) D4476 (C y3 ) 5’ Io do tu be rc idi n (C y5 ) 7 4 6 11[Pi] Essa i (R ou ge ) D4476 (V er t) 7 4 6 11[Pi] Essa i (R ou ge ) 5’ Io do tu be rc idi n (V er t) 7 4 6 11[Pi] D4476 (R ou ge ) 5’ Io do tu be rc idi n (V er t) 7 4 6 11[Pi]avec un scanner Typhoon (Amersham Biosciences) et les images obtenues ont été traitées avec le logiciel ImageJ afin d’ajuster l’intensité du signal entre les images et créer les superpositions (Figure 30).
Les images en noir et blanc correspondent aux images obtenues individuellement pour chaque échantillon (extrait total, surnageant et élution) (Figure 30A). Le signal obtenu avec le Cy5 (élution) a été légèrement augmenté afin de visualiser les protéines faiblement abondantes. La migration en deux dimensions a séparé les nombreuses protéines de même masse, et ainsi permis aux protéines de faible abondance de se distinguer par rapport aux protéines abondantes. Les images en couleur (Figure 30B, 30C & 30D) correspondent à la superposition des images obtenues dans la Figure 30A. La couleur verte ou rouge est attribuée arbitrairement aux signaux de fluorescence de l’une ou l’autre des images à comparer et la superposition des deux images colorisées peut faire apparaitre des signaux jaunes qui correspondent aux signaux communs entre les deux images et indiquent que ces protéines sont présentes dans les deux échantillons, tandis que les signaux rouges ou verts correspondent aux protéines présentes dans l’un ou l’autre des échantillons. Grace à cette superposition, la technique 2D-DiGE révèle son efficacité car elle permet de comparer simultanément les protéines présentes dans deux échantillons.
La comparaison de l’extrait total (rouge) avec le surnageant (vert) montre que la majorité des signaux sont jaunes, indiquant que la majorité des protéines présentes dans les deux échantillons sont identiques (Figure 30B). Cependant, j’observe un certain nombre de signaux rouges indiquant que ces protéines ne sont plus présentes dans le surnageant et donc qu’elles ont été capturées par l’ATP-Agarose. Ces protéines sont encore plus visibles lorsque l’on compare l’élution (rouge) avec le surnageant (vert) (Figure 30C). En effet, quasiment aucun signal jaune n’est visible, indiquant que la quasi-totalité des protéines capables de fixer à l’ATP-Agarose ne sont plus présentes dans le surnageant. Et finalement, la comparaison de l’élution (rouge) avec l’extrait total (vert) permet de visualiser ces protéines dans le protéome total (Figure 30D). Toutefois, cette comparaison ne me permet pas de juger de l’enrichissement des protéines présentes dans l’élution étant donné que le signal obtenu avec le Cy5 (élution) a été légèrement augmenté et fausse
ainsi toute quantification. Pour conclure, ces résultats montrent qu’il est possible de visualiser les différences entre les protéines présentes dans l’élution et celles présentes dans le surnageant ou l’extrait total. Il devrait donc être tout à fait possible de visualiser les différences entre les protéines présentes dans l’élution d’un Essai et celles d’une compétition pour déterminer la spécificité de nos composés.
4.2.2. Preuve de principe
Pour déterminer la spécificité de nos composés par 2D-DiGE, j’ai décidé d’établir une preuve de principe en utilisant les composés D4476 (spécifique) et 5’Iodotubercidin (pléiotropique). Pour cela, j’ai réalisé des chromatographies d’affinité compétitives avec ces deux composés (Résultats II.4.1.2). Ensuite, les protéines contenues dans les élutions de chaque condition ont été précipitées, marquées et réunies comme décrit précédemment (Résultats II.4.2.1). La moitié du mélange des échantillons a été chargé sur un IPG Strip pH 4-7 et l’autre moitié sur un IPG Strip pH 6-11, afin de couvrir l’intégralité des points isoélectriques des protéines présentes dans mes échantillons. Une focalisation isoélectrique suivi d’électrophorèses sur 2DHPE™ Large Gels 12,5% ont été effectuées, et les signaux de fluorescence ont été acquis avec un scanner Typhoon (Amersham Biosciences) (Matériel & méthodes II.2.10). Les images obtenues ont été traitées avec le logiciel ImageJ afin d’ajuster l’intensité du signal et de créer les superpositions (Figure 31).
Premièrement, je constate que l’utilisation des IPG Strips pH 4-7 et 6-11 couplée à l’électrophorèse sur 2DHPE™ Large Gels a permis d’accroître fortement la résolution des protéines, bien que la focalisation isoélectrique pour l’IPG Strip pH 6-11 ne soit pas faite sur l’intégralité de celui-ci (environ 2/3) (Figure 31A). Deuxièmement, l’ensemble des signaux obtenus pour l’Essai et les compétitions sont assez similaires, bien que l’intense bruit de fond sur les images de l’Essai masque les protéines faiblement abondantes qui sont clairement visibles pour les compétitions. Pour les comparaisons
de l’Essai (rouge) avec les composés (vert)
(Figure 31B & 31C), il est difficile d’interpréter les résultats en raison du bruit de fond présent dans l’Essai. Toutefois, pour la comparaison avec le D4476, tous les signaux visibles sont jaunes, indiquant que les protéines présentes dans les deux 56