MATERIELS ET MÉTHODES
F. Analyses statistiques
III. Profil transcriptionnel des lymphocytes Th1 et Th9 stimulés avec le cGAMP
Pour déterminer par quels mécanismes l’activation de STING favorise les différenciations Th1 et Th9, nous avons analysé les voies de signalisation induites par l’activation de STING dans les CD4 naïfs stimulés ou non avec le cGAMP pendant 6h. Nous avons ainsi pu mettre en évidence par Western Blot, que le cGAMP induisait très rapidement la phosphorylation des protéine STING et TBK1 (Fig 21A) ainsi que la translocation nucléaire des protéines P65 et IRF3 phosphorylées (Fig 21B). De plus, l’expression des interférons de Type I (Ifna, Ifnb), des ISG (Ifit1, Ifit2, Cxcl10, Mx2) et des cytokines pro-inflammatoires (Tnfa, Il6) a été analysé par qPCR, et les résultats montrent une forte augmentation de l’expression de ces gènes après 6h de stimulation avec le cGAMP (Fig 21C).
Afin de mieux comprendre le rôle de la signalisation STING au sein des lymphocytes Th1 et Th9 nous avons analysé ces cellules stimulées ou non avec le cGAMP à 16 et 48h par séquençage de l’ARN (RNAsequencing). L’analyse d’enrichissement d’ensemble de gènes (Gène Set Enrichment Analysis, GSEA) a Figure 21: La voie de signalisation STING est induite dans les CD4 stimulés avec le cGAMP
Des cellules T CD4 naïves issus de souris WT ont été stimulées avec du cGAMP pendant 4h (A) ou 6h (B, C).
A. Analyse de l’expression de STING, TBK1 et de leurs formes phosphorylées par Western Blot
B. Analyse de la localisation cellulaire (Cytosol, Cyt ou Noyau, Nuc) d’IRF3, P65 et de leurs formes phosphorylées par Western Blot
C. Analyse qPCR (Heatmap, Log2FC) des gènes associés à l’activation de STING (Ifna, Ifnb1, Ifit1, Ifit2, Mx2, Cxcl10, Tnfa et Il6)
permis de montrer, quel que soit le sous type lymphocytaire, que l’activation de la voie de signalisation STING par le cGAMP favorisait l’expression des ensembles de gènes suivants : Régulation de la production des Interférons de type I (GO:0032479), Gènes Stimulées par les Interférons (ISG), et Régulation de la réponse inflammatoire (GO:0050727). Ces données montrent que les lymphocytes T CD4 différenciés et stimulés avec le cGAMP, présentent un profil transcriptionnel pro-inflammatoire associé à la signalisation STING qui se maintient dans le temps (au moins 48h) (Fig 22A + Annexes 2). De plus, nous avons pu mettre en évidence une augmentation de plusieurs cytokines effectrices et chimiokines telles que l’Ifng, l’Il2, le Gzmb et le Ccl4 dans les lymphocytes Th1, et l’Il9, l’il21, le tnfsf4 (OX40L), tnfsf8 ou encore l’Il10 dans les lymphocytes Th9 (Fig 22B). Néanmoins, nous n’avons pas noté de régulation marquée des facteurs de transcription clés associés aux différenciations Th1 et Th9. En plus de l’augmentation respective de l’IFN- et de l’IL-9, ces données montrent un profil plutôt pro-inflammatoire des cellules Th1 et Th9 stimulées avec le cGAMP.
Figure 22 : Analyse RNAseq des cellules CD4 naïves stimulées avec le cGAMP et polarisées 16 et 48h en Th1 et Th9
A. Analyse GSEA à 16h. Régulation de la production des Interférons de type I (GO:0032479), Gènes Stimulées par les Interférons (ISG), et Régulation de la réponse inflammatoire (GO:0050727).
IV. L’activation de STING augmente la sécrétion d’IFN-
des Th1 de
manière dépendante de l’axe IRF3/IFN-β/IFNAR
Nous nous sommes ensuite intéressés aux mécanismes conduisant à l’augmentation d’IFN- et d’IL-9 dans les lymphocytes Th1 et Th9 respectivement. Tout d’abord, comme nous avions noté dans l’analyse RNAseq, mais également in vivo, une forte induction des programmes transcriptionnels associés aux Intérférons de type I et aux ISG, nous avons voulu savoir dans quelle mesure l’activation de la voie STING modulait la production d’IFN-β dans les lymphocytes T CD4 in vitro. Nous avons pu montrer que le cGAMP induisait une forte augmentation de l’expression d’Ifnb, et que les deux sous types lymphocytaires Th1 et Th9 sont capables de sécréter l’IFN-β (Fig 23A). Nous avons ainsi testé si l’augmentation d’IFN- et d’IL-9 pouvait résulter d’un mécanisme autocrine par l’intermédiaire du récepteur aux Interférons de Type I (IFNAR). Si une déficience pour ce récepteur (IFNAR-/-) n’empêche pas le cGAMP
d’induire une augmentation de l’IL-9 dans les Th9 (Fig 23D), il est cependant indispensable pour l’induction d’IFN- dans les Th1 (Fig 23B et C).
Sachant que l’expression d’Ifnb est médiée principalement par le facteur de transcription IRF3 et que la translocation de phospho-IRF3 dans le noyau est fortement induite après stimulation avec le cGAMP dans les lymphocytes T CD4 (Fig 21B), nous avons testé l’implication de ce facteur de transcription dans l’augmentation d’IFN- et d’IL-9. Encore une fois, si IRF3 est indispensable pour l’augmentation d’IFN- médiée par STING dans les Th1 (Fig 24A et B), il ne semble pas requis pour les cellules Th9 dans ce contexte (Fig 24C).
Figure 23: Rôle des Interférons de Type I dans l’augmentation des propriétés effectrices médiée par le cGAMP.
Des cellules CD4 naïves issus de souris WT ou IFNAR-/- (B-D) ont été stimulées avec le cGAMP et polarisées en Th1 ou Th9.
A. Analyse de l’expression d’Ifnb1 (Fold Change, FC) et de la sécrétion d’IFN-β par qPCR et ELISA à 16h et 48h.
B. Analyse de la production d’IFN- des cellules Th1 par cytométrie en flux.
C-D. Analyse de l’expression d’Ifng et d’Il-9 (FC) ainsi que de la sécrétion d’IFN- et d’IL-9 par qPCR et ELISA respectivement.
Figure 24 : Rôle d’IRF3 dans l’augmentation des propriétés effectrices médiée par le cGAMP.
Des cellules CD4 naïves issus de souris WT ou IRF3-/- ont été stimulées avec le cGAMP et polarisées en Th1 ou Th9.
A. Analyse de la production d’IFN- des cellules Th1 par cytométrie en flux.
B-C. Analyse de l’expression d’Ifng et d’Il-9 (FC) ainsi que de la sécrétion d’IFN- et d’IL-9 par qPCR et ELISA respectivement.
L’ensemble des résultats montrent que l’augmentation de l’IFN- dans Th1 induite par l’activation de STING est dépendante de la signalisation IRF3/IFN-β/IFNAR. En revanche cette voie ne semble pas impliquée dans l’effet du cGAMP sur la sécrétion d’IL-9 des cellules Th9. Ainsi, ces résultats suggèrent que les mécanismes de modulation des propriétés effectrices des cellules T CD4 médié par STING, varient en fonction du sous type lymphocytaire et des conditions de polarisation. Par ailleurs ces données sont en accord avec nos résultats précédents montrant une sensibilité différente des Th1 et des Th9 dans la mort induite par l’activation de STING.