L’activation de STING augmente la sécrétion d’IL-9 des Th9 de manière dépendante de la voie mTOR

L’augmentation de la sécrétion d’IL-9 des cellules Th9 à la suite de l’activation de STING n’étant pas médiée par l’axe IRF3/IFN-β/IFNAR, nous avons cherché quel mécanisme alternatif pouvait être impliqué. En plus de cet axe, l’activation de STING permet d’induire la voie de signalisation NF-B (fig 21B) et il a été montré que P65 pouvait se fixer sur le promoteur de l’Il9 pour augmenter son expression (Jash, Sahoo et al. 2012). D’ailleurs l’analyse RNAseq nous a permis de voir un enrichissement significatif des gènes impliqués dans la régulation de cette voie de signalisation dans les Th9 stimulés avec le cGAMP à 16h et 48h (Annexe 2). Pour évaluer l’implication de P65 dans l’augmentation d’IL-9 induite par le cGAMP, nous avons généré des souris conditionnellement déficientes pour P65 dans les lymphocytes T (P65-CD4cre +/-). Bien qu’une déficience en P65 réduit la sécrétion d’IL-9 des cellules Th9, le cGAMP parvient toujours à augmenter significativement leur expression et sécrétion d’IL-9 (Fig 25A).

Imanishi et al. ont récemment montré que la protéine mTORC1 était requise pour la production d’IFN-β médié par l’activation de STING (Imanishi, Unno et al. 2019). Par ailleurs, il a également été montré qu’une augmentation de la signalisation mTOR favorisait la différenciation Th9 promouvant alors leurs propriétés inflammatoires et antitumorales (Wang, Bi et al. 2016). Ainsi nous avons testé l’activation de la signalisation mTOR, dans les cellules Th9 stimulées avec du cGAMP. Les résultats de Western Blot montrent bien que le cGAMP augmente la phosphorylation des protéines effectrices S6 et p70S6K en aval de la voie mTOR, et que l’utilisation d’un inhibiteur de la voie mTOR, la rapamycine, compromet cette

signalisation (Fig 25B). Par ailleurs nous avons pu mettre en évidence que l’utilisation de la rapamycine inhibait également l’effet du cGAMP sur la sécrétion d’IL-9, suggérant une implication de la voie mTOR dans l’augmentation de l’IL-9 induite par l’activation de STING (Fig 25C et D).

Figure 25 : Rôle de P65 et mTOR dans l’augmentation des propriétés effectrices des Th9 médié par le cGAMP.

A. Analyse de l’expression d’Ifng et d’Il-9 (FC) ainsi que de la sécrétion d’IFN-γ et d’IL-9 par qPCR et ELISA respectivement de cellules CD4 naïves issus de souris P65^CD4+/+ ou P65^CD4cre/+ stimulées avec le cGAMP et polarisées en Th9.

B-D. Des cellules CD4 naïves issues de souris WT ont été stimulées avec le cGAMP en présence ou non de rapamycine et polarisées en Th9. (Rapa = rapamycine ; Veh = Vehicle) B. Analyse de l’expression de p-p70S6K et p-S6 par Western Blot

C. Analyse de la production d’IL-9-GFP par cytométrie en flux.

D. Analyse de l’expression d’Il-9 (FC) ainsi que de la sécrétion d’IL-9 par qPCR et ELISA respectivement.

Les cellules Th9 ont été décrites comme étant le sous type lymphocytaire T CD4 possédant les propriétés antitumorales les plus efficaces dans un contexte de transfert adoptif, en particulier dans le mélanome (Lu, Wang et al. 2018). Ainsi nous avons utilisé le modèle murin de mélanome B16-OVA, et procédé au transfert adoptif de cellules Th9 issus de souris OTII (exprimant un TCR spécifiques de l’Ovalbumine). Nous avons ainsi pu mettre en évidence que les cellules Th9-OTII stimulées avec le cGAMP présentaient une augmentation de leur expression d’Il9 (Fig 26A). Par ailleurs le transfert adoptif de ces Th9 stimulées permet un meilleur contrôle de la croissance des tumeurs B16-OVA injectées en sous cutané (Fig 26B), mais également une meilleure réduction des foyers tumoraux pulmonaires après injection des cellules B16-OVA par voie intraveineuse, en comparaison aux cellules Th9 non stimulées (Fig 26C).

Figure 26 : Le cGAMP augmente les propriétés antitumorales des cellules Th9.

Des cellules CD4 naïves issues de souris OTII ont été stimulées avec le cGAMP ou son contrôle et polarisées en Th9, puis injectées en intraveineuse (i.v) chez des souris porteuses de tumeurs B16-OVA (s.c ou i.v)

A. Analyse de l’expression d’Il9 (FC) par qPCR.

B. Croissance tumorale dans des souris WT porteuses de tumeurs B16-OVA (s.c) et traitées ou non (PBS) par transfert adoptif de Th9 (stimulées ou non avec le cGAMP)

C. Foyers tumoraux pulmonaires énumérés après sacrifice de souris WT porteuses de tumeurs B16-OVA (i.v) et traitées ou non (PBS) par transfert adoptif de Th9 (stimulées ou non avec le cGAMP)

Ainsi l’activation de STING avec le cGAMP permet d’augmenter l’IL-9 et le propriétés antitumorales des cellules Th9 dans un contexte de transfert adoptif. Afin de déterminer si ces données ont une pertinence chez l’homme, nous avons également testé si le cGAMP permettait d’augmenter l’IL-9 sécrétée par les cellules Th9 humaines. Des cellules T CD4 naïves ont été isolées à partir du sang de 3 donneurs sains, et ont été différenciées en Th9 après avoir été stimulées avec le cGAMP. Les résultats montrent que l’activation de la voie STING par le cGAMP augmente les propriétés effectrices des cellules Th9 humaines (Fig 27A et B).

L’ensemble de ces données montrent que l’’activation de STING peut augmenter les propriétés effectrices et antitumorales des cellules Th9 dans un contexte de transfert adoptif.

Figure 27 : Le cGAMP augmente la sécrétion d’IL-9 des lymphocytes Th9 humains

Des cellules CD4 naïves issues de sang de patients sains ont été stimulées avec le cGAMP et polarisées en Th9.

A. Analyse de l’expression d’IL9 (FC) par qPCR. B. Analyse de la sécrétion d’hIL-9 par ELISA.

Ces travaux ont permis de mettre en évidence le rôle clé de la protéine STING dans la biologie des lymphocytes T CD4. Le cGAMP permet notamment de moduler les propriétés effectrices des cellules T CD4 par divers mécanismes : un axe IRF3/IFN-β/IFNAR pour l’augmentation d’IFN- dans les Th1, et un axe mTOR pour l’augmentation d’IL-9 dans les Th9. Ces différences observées permettent par ailleurs d’expliquer en partie la différence de sensibilité des Th1 et des Th9 par rapport à la mort induite par STING. Par ailleurs l’activation de STING in vivo peut favoriser la sécrétion d’IFN- par les CD4 au sein de la tumeur, mais également augmenter les propriétés antitumorales des Th9 dans un contexte de transfert adoptif, soulignant le potentiel thérapeutique de ces travaux (Figure 28).