Production des vecteurs lentiviraux

III.2.4.1. Production virale

Les lentivirus sont produits par transfection transitoire dans des cellules 293T. 5 x 10⁶ cellules 293T ont été ensemencées dans des boîtes de pétri de 10 cm de diamètre 24h avant la transfection. Un total de 21 µg d'ADN plasmidique a été utilisé pour la transfection d'une boite: 3 µg de plasmide pMD2-G, 6 µg de plasmide pCMV_dR8.91, et 12 µg de vecteur de transfert pSicor-luciférase. 24h après la transfection, le milieu de culture a été changé. Les surnageants contenant les vecteurs lentiviraux ont été récoltés 48 h après la transfection, filtrés à travers des filtres de 0,45 µm d'acétate de cellulose (Millipore SLHV033RS), et concentrés deux fois par centrifugation sur des colonnes Vivaspin ayant une capacité de filtration de 50 kDa (Sartorius Intec, référence VS2031). La concentration de l'antigène p24 viral a été déterminée par le test ELISA (Innotest! HIV Antigen mAb, InnoGenetics, Belgium référence 80563). Le stock viral est conservé dans des aliquots de 1 mL à une température de -80°C.

III.2.4.2. Marquage des lentivecteurs avec le dérivé de la

fluorescéine FlAsH

Nous avons marqué les surnageants viraux (1-X$ a=$ .(/9%)7!'/*,$ 3X]A0F) à température ambiante avec 0,8 µM de FlAsH EDT2 (Molecular probes T34561), 1 mM beta-mercaptoéthanol, 1 mM TCEP Tris(2-carboxyethyl)phosphine dans un volume total de 1 mL. Pour contrôler la spécificité de notre marquage, nous avons remplacé les pseudovirus NC-TC ou IN-TC par les pseudovirus WT. Après 2 h, les pseudovirus marqués ont été purifiés par ultracentrifugation à 40000 rpm pendant 30 min pour éliminer le FlAsH non lié. Les

89 particules virales ont été resuspendues dans 300 µL de PBS 1X (Arhel et al., 2006a; Lelek et al., 2012).

III.2.4.3. Dosage de l'activité luciférase

R-%&$#7!'%/&$'()*D/6,)7),#$./$*-"$'/*,)7/6,/%&"$"!%7!=/"$LwNI$/,$0%,#"$L12-TC, IN-TC, TC-NC), des cellules HeLa ont été mises en culture dans des plaques 6 puits, à raison de 3 x 10⁵ cellules par puits, 24 +$ !7!*,$ .(G,&/$ )*D/6,#/"$ 3!&$ .%$ "%&*!=/!*,$ 7)&!'$ "!%7!=/$ -%$ 0%,#$ équivalent à 60 ng de p24 (par puits : un équivalent de 60 ng p24 dans 2 mL de DMEM additionné de polybrène 8 µg/mL)E$C3&@"$X]+$.()*D/6,)-*H$'/"$6/''%'/"$-*,$#,#$'!7#/"$3!&$X$0F$ de PBS 1X et lysées directement dans les puits avec 500 µL du tampon de lyse (cell culture Lysis buffer, Promega E153A supplémenté de 0.5 % Triton-X100) pendant 20 min à température ambiante. F(!6,)7),#$ ./ la luciférase a été mesurée avec le kit luciferase assay system (Promega, E1500) selon le protocole du fabricant, en utilisant un luminomètre (Berthold, TriStar LB941). Brièvement, 20 µL d'échantillon est introduit dans chacun des 3%),"$.(%*/$3'!9%/$`h$3%)," (plaque blanche, Greiner Bio-One reference 655 075). 70 µL de substrat de la luciférase (kit Promega E1500) est injecté et la luminescence est mesurée juste !3&@"$'(!..),)-*$.%$"% ",&!,$3/*.!*,$%*$,/03"$.()*,#=&!,)-*$./$S<".

III.2.5. D%5'*+!(2)%&'(3('4*%'*ED-qPCR

III.2.5.1. BF'(2&'("2*+%*,!%F./%55("2*+%*,-*./"'4(2%*=G" HI*%'*

infection des cellules HeLa

F(/J,)*6,)-*$./$'(/J3&/"")-*$./$'!$3&-,#)*/$+1-FSX$/*.-=@*/$!$#,#$/DD/6,%#/$3!&$,&!*"D/6,)-*$ transitoire de siRNA (sihNoL12). Des cellules HeLa ont été étalées dans des plaques 6 puits à une concentration de 10⁵ cellules/puits. Le lendemain, les cellules ont été transfectées avec soit 50 nM de siControl soit 50 nM de sihNoL12 (Dharmacon LU-015834-00-0002 et L-014330-02), /*$ %,)')"!*,$ '(!=/*,$ ./$ ,&!*"D/6,)-*$ ?+!&0!D/6,S$ (Dharmacon, Dharmafect1, T-2001-02) selon les instructions du fabricant. 72 h post-transfection, les cellules ont été infectées par le vecteur lentiviral (par puits : un équivalent de 360 ng de p24 dans 2 mL de DMEM complet additionné de polybrène 8µg/mL final). La zidovidune AZT a été utilisée comme contrôle positif dans ces expériences (par puits : AZT 1 µM dans 2 mL de DMEM complet). Après 8 h de contact avec les pseudovirus, le milieu a été changé et remplacé par du

90 nouveau milieu sans virus (avec AZT 1 µM dans les puits contrôle positive) et les cellules -*,$#,#$)*6% #/"$K%"9%(8$]_ h post-infection, avant la lyse et extraction de l'ARN.

III.2.5.2. BF'/-&'("2*+%*,!JEG

F(/J,&!6,)-*$./$''ARN a été effectuée avec le kit RNeasy Mini plus (Qiagen référence 74134) selon les instructions du fabricant. Brièvement, les cellules sont lysées directement dans les puits avec Y;<$xF$./$,!03-*$./$'B"/$MFN PLUS fourni avec le kit. Les lysats sont transférés dans une colonne qui pe&0/,$.(#')0)*/&$'(C?1$=#*-0)9%/$LgDNA Eliminator spin column). Ensuite, un volume d'éthanol à 70% (350 µL) est ajouté au filtrat et le mélange est chargé dans la colonne RNeasy. La colonne est lavée par 4<<$ xF de tampon RW1 et 500 µL de tampon RPE. Finalement, l'ARN est élué de la colonne par ;<$ aF$ .(/!%$ "!*"$ M1!"/E$ F!$ 6-*6/*,&!,)-*$ ./"$ #6+!*,)''-*"$ /*$ CM1$ !$ #,#$ .#,/&0)*#/$ =&p6/$ 8$ '(%,)')"!,)-*$ .(%*$ spectrophotomètre (Nanodrop).

III.2.5.3. Reverse transcription

La reverse transcription de l'ARN en ADNc a été effectuée =&p6/$ 8$ '(%,)')"!,)-*$ .%$ k),$ iScript^TM Select cDNA Synthesis (Bio-Rad référence 1708896). La réaction est effectuée dans un volume total de 20 µL contenant : 1 µg d'ARN total, 4 µL de 5X RT reaction mix, 1 µL de transcriptase inverse iScript, et le volume final est complété à 20 µL avec de l'eau sans nucléases. Le mix est incubé pendant 5 min à 25^yC, 30 min à 42^yC puis 5 min à 85^yC dans un thermocycleur Biorad T100.

III.2.5.4. PCR quantitative (qPCR)

Les réactions de qPCR ont été réalisées en utilisant le kit Fast SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612). Chaque mélange réactionnel contient 300 nM de chacune des amorces forward et reverse, 50 ng d'ADNc, et 10 µL de 2X Fast SYBR® Green Master Mix dans un volume réactionnel total de 20 µL.

Les réactions sont préparées dans une plaque 96 puits (MicroAmp®, Applied Biosystems, 4346907). Ensuite, la plaque est scellée avec un film adhésif, centrifugée à 1600 rpm pendant 3 min et placée dans un ABI 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Pour '(!03'ification, nous avons utilisé le programme suivant : 95^yC pendant 20 s et 40 cycles de

91 95^yC pendant 3 s et 60^yC pendant 30 "E$ F!$ 9%!*,),#$ .(CM10$ 6-.!*,$ '!$ '%6)D/&!"/$ /",$ *-&0!')"#/$"%&$6/''/$./$'(CM1$&) -"-0!'$S_dE$

F/"$ 9%!*,),#"$ &/'!,)7/"$ .(C?16$ .!*"$ '/"$ différents échantillons ont été estimées par la méthode de calcul des ^^2,E Pour obtenir une valeur relative du taux .(/J3&/"")-* du gène .()*,#&G, dans un échantillon de référence, la quantité du gène cible est .(! -&. normalisée par rapport à un gène de référence (18S). Une valeur ^2, test obtenue pour chaque échantillon dont un échantillon est défini comme calibrateur. Ensuite, pour chaque échantillon, la valeur du ^2, est comparée à la valeur du ^2, obtenue pour '(#6+!*,)''-* calibrateur : une valeur de ^^2, est ainsi obtenue. Dans chaque échantillon, la quantification relative (QR) du gène cible par rapport à '(#6+!*,)''-* de référence est donnée par la formule QR=2^{- ^^2,}

F/"$ !0-&6/"$ %,)')"#/"$ !%$ 6-%&"$ ./$ '(!03')D)6!,)-*$ "-*,$ '/"$ "%)7!*,/"j Luciférase : Forward: 5'-TGAGTACTTCGAAATGTCCGTTC-3'

Reverse: 5'-GTATTCAGCCCATATCGTTTCAT-3' ARN ribosomal 18S: Forward: 5'-TGTGGTGTTGAGGAAAGCAG-3'

Reverse: 5'-TCCAGACCATTGGCTAGGAC-3'