Import nucléaire et intégration

='/*)#602<O*E,4,-. de la transcription inverse, l'ADN proviral est transporté, au sein du PIC, vers le noyau. La composition du PIC est toujours fortement débattue. Plusieurs études E26&+,-.#62#'/1),-<,#+,#a'/#,.#\=#,-#'6%)#+,#60=P?#E&/26#,.#+,#60V?#(Iordanskiy et al., 2006; Miller et al., 1997). A noter que la présence de la protéine de nucléocapside NCp7 au sein du PIC est un sujet de controverse (Farnet and Haseltine, 1991; Gallay et al., 1995; Karageorgos et al., 1993; Thomas and Gorelick, 2008). De nombreux facteurs cellulaires ont également été /,./(%E1)# +2-)# +,)# 1.%+,)# +,# <2/2<.1/&)2.&(-# +%# IVG# +(-.# 6,)# '/(.1&-,)# +,# 6&2&)(-# 9# 60=P?#

37 BAF (Barrier to Autointegration Factor) (Chen and Engelman, 1998; Karn, 1999), HMG1(Y) (High Mobility Group) (Farnet and Bushman, 1997), KU de la voie « jonction d'extrémités non homologues k#+,#/1'2/2.&(-#+,#60=P?#(Li et al., 2001) et LEDGF/p75 (Lens Epithelium-Derived Growth Factor -75kDa) (Llano et al., 2004) .(%.,)#&4'6&$%1,)#+2-)#60&-.13/2.&(-#+,)# rétrovirus.

>*=8'/%?@%-% /1%A+43/8'1%)*'+8B%C"D%:&'D%;$D%/3%EEF4%(23%030%904'*31%&(8'%A+4*,*3/'%,!*6&('3%284,0+*'/%98% PIC via les pores nucléaires. Bien que MA et Vpr aient été décrites pour interagir avec les importines et les nuc61('(/&-,)8# 60&4'6&<2.&(-# +,# <,)# &-.,/2<.&(-)# +2-)# 60&4'(/.# -%<léaire du PIC est controversée. Adaptée de Suzuki and Craigie, 2007.

La taille du PIC, supérieure à 60 kDa, exclue la possibilit1#+0%-#&4'(/.#-%<612&/,#'2/#+&CC%)&(-# passive et implique un transport actif à travers la membrane nucléaire (Figure 13). Plusieurs des protéines du PIC possèdent des NLS (MA, IN et Vpr) contribuant ainsi aux propriétés

!"#$%&"'(! )*&+,(-($'!# !"#$%&"'(! )*&+,(-+%./# 0!1#+(--#2 !*&+,%'$# 3 4

38 karyophiliques du PIC (Sherman and Greene, 2002; Suzuki and Craigie, 2007). Ces propriétés )(-.# 1./(&.,4,-.# 6&1,)# 9# 62# 42<O&-,/&,# +0&4'(/.# -%<612&/,# <,66%62&/,8# ,.# ,-# '2/.&<%6&,/# 2%;# protéines &4'(/.&-,# l8# J/2-)'(/.&-# L8# ?%'7RL# ,.# ?%'LRm# @'(%/# /,E%,# E(&/# Fassati, 2012; Matreyek and Engelman, 2013). Cependant, la participation de ces protéines virales dans 60&4'(/.#-%<612&/,#+%#IVG#/,).,#<(-./oversée (Fassati, 2006; Piller et al., 2003; Riviere et al., 2010)F#K-#2%./,#1614,-.#E&/268#60=P?#d62'#serait impliqué dans l'import nucléaire du PIC (Ao et al., 2004; Zennou et al., 2000). Des mutations, au niveau du PPTc conduisent à un ADN génomique viral 6&-12&/,# +1'(%/E%# +,# 60=P?# d62'# <,-./268# ,-./2&-ant une réduction <(-)&+1/2D6,# +,# 62# /1'6&<2.&(-# E&/26,F# =6(/)# $%,# 60=P?# E&/26# )2%E23,# ,).# ,-# 3/2-+,# 'artie ./2-)'(/.1#+2-)#6,#-(N2%8#6,)#31-(4,)#+1'(%/E%)#+0=P?#d62'#)02<<%4%6,-.#9#62#'1/&'O1/&,#+,# 60,-E,6('',#-%<612&/,#&-+&$%2-.#%-#+1C2%.#+0&4'(/.#-%<612&/,#(Arhel et al., 2007). Des données récentes ont également souligné l'importance de la capside dans 60&4'(/.#-%<612&/,#+%#IVGF#W-# effet, 602))(<&2.&(-#+, molécules de CA au PIC (Arhel et al., 2007; Dismuke and Aiken, 2006) ,.# 60&+,-.&C&<2.&(- de partenaires protéiques cellulaires de CA dans la voie d'import/export -%<612&/,#)%33*/,-.#60&4'6&<2.&(-#+,#62#capside dans cette étape du cycle viral (Matreyek and Engelman, 2013). Le fait que cette question reste à ce jour non résolue est probablement lié à 62# 3/2-+,# /,+(-+2-<,# +,)# )&3-2%;# +0&4'(/.# -%<612&/,)# ./(%E1)# )%/# 6,)# +&CC1/,-.)# <(4'()2-.)# du PIC.

Après l'import nucléaire, l'ADN proviral est intégré dans le génome de la cellule l'hôte (Craigie and Bushman, 2012). L'intégration peut être divisée en trois étapes (Figure 14). Dans %-#'/,4&,/#.,4')8#60V? reconnaît spécifiquement les deux LTR aux extrémités de l'ADN viral (Kukolj and Skalka, 1995) ,.# <6&E,# 6,)# +,%;# +,/-&,/)# -%<61(.&+,)# ,-# L0# +,# <O2<%-# +,s deux D/&-)#+0=P?#6&D1/2-.#%-#+&-%<61(.&+,#G=#(fortement conservé) 2&-)&#$%0%-,#,;./14&.1#L0]M# @L0# '/(<,))&-3BF# I2/# 62# )%&.,8 l'IN clive l'ADN génomique de la cellule cible et catalyse 60&-),/.&(-#+,#60,;./14&.1#G=-]M#L0#+2-)#6,#31-(4,#<,66%62&/,#@./2-)C,/.#+,#D/&-BF#d&-26,4,-.8# 6,)# ,-bN4,)# <,66%62&/,# +,# /1'2/2.&(-# +,# 60=P?# &-.,/E&,--,-.# '(%/# <(//&3,/# 6,) discontinuités entre les ADN cellulaire et viral (Engelman et al., 1991; Vink et al., 1991a; Vink et al., 1991b).

!:&-.13/2.&(-# +%# '/(E&/%)# +2-)# 6,# 31-(4,# +,# 62# <,66%6,# O^.,# -0,).# '2)# 2612.(&/,8# elle a préférentiellement lieu au niveau de sites activement transcrits appelés « points chauds » (Lewinski et al., 2006; Schroder et al., 2002). La plupart des cellules infectées contiennent

39 plus d'un provirus intégré (Jung et al., 2002)F#!,)#)&.,)8#6,#-(4D/,#,.#60,CC&<2<&.1#+0&-.13/2.&(-# semblent influencés par plusieurs protéines cellulaires (Bushman et al., 2005; Suzuki and Craigie, 2007). Ces protéines comprennent le LEDGF / p75 (De Rijck et al., 2010; Marshall et al., 2007), l'HMG-I(Y), protéine architecturale de la chromatine (Farnet and Bushman, 1997) ; la sous-unité SNF5/Ini1 du complexe de remodelage de la chromatine ; le complexe SWI/SN de remodelage du nucléosome (Kalpana et al., 1994) et la protéine BAF (Chen and Engelman, 1998).

Par ailleurs, la protéine virale NCp7 jouerait également un rôle stimulateur +,# 60&-.13/2.&(-8# comme cela est décrit dans la section I.4 de ce manuscrit.

40

>*=8'/% ?G-% ./&'01/23+3*(2% 14506+3*78/% 9/% ,!*230='+3*(2% 9/% ,!"#$% &'()*'+,% 9+21% ,/% =02(6/% 9/% ,+% 4/,,8,/% cibleF#!,)#,;./14&.1)#+,#6:=P?#E&/26#)(-.#/,<(--%,)#,.#<6&E1,)#'2/#60&-.13/2),, ce qui permet l'élimination de deux nucléotides (TG) à chacune des extrémités 3' (3' processing). L'ADN cible cellulaire est également clivé par 60&-.13/2),F# I2/# 62# )%&.,8# 6,)# ,;./14&.1)# L0]M# +,# 6:=P?# E&/26# )(-.# 6&1,)# 2%;# ,;./14&.1)# R0'O()'O2.,# +,# 60=P?# c,66%62&/,#@./2-)C,/.#+,#D/&-BF#d&-26,4,-.8#6,)#+&)<(-.&-%&.1)#,-./,#60=P?#<,66%62&/,#,.#E&/26#)(-.#<(//&31,)#'2/#+,)# enzymes cellulaires.

I.3.5. !/B&'/11*(2%98%=02(6/%)*'+,

='/*)#&-.13/2.&(-#+2-)#6,#31-(4,#+,#62#<,66%6,#O^.,8#6:=P?#'/(E&/268#<(44,#60=P?#<,66%62&re, est retrouvé au sein de nucléosomes (Gatignol, 2007), cet état très structuré et condensé de la

41 chromatine peut restreindre l'accès aux facteurs cellulaires régulant la transcription et réprimer 60,;'/,))&(-#+,#6:=P?#'/(E&/26#&-.13/1#/1)%6.2-.#,-#%-#1.at de latence virale (Gatignol, 2007; Marcello, 2006).

La protéine Tat du VIH-1 recrute certains facteurs de remodelage ou de modification de la chromatine comme SWI/SNF, CBP (p300/CRE binding protein), PCAF (P300/CBP-associated factor) et la protéine hGCN5. Ces facteurs agissent par acétylation des histones permettant le déroulement des nucléosomes et par conséquent l'accessibilité de protéines cellulaires au promoteur viral (Gatignol, 2007).

La transcription des gènes viraux qui nécessite la machinerie transcriptionnelle de la cellule infectée est en effet régulée par plusieurs protéines cellulaires et virales. La région 5'-LTR contient les éléments promoteurs nécessaires à la transcription du provirus par l'ARN polymérase II cellulaire (ARNpII). Elle possède également des sites de liaison pour de nombreux facteurs de transcription, y compris Sp1, NF-kB, AP-1 et NF-AT (Garcia et al., 1992; Leonard et al., 1989; Pereira et al., 2000; Ross et al., 1991)F# !0=>?'VV# '/1),-.,# %-,# faible processivité quand son domaine C-terminal (CTD) est hypophosphorylé et associé à la protéine DSIF (DRB-sensitivity inducing factor) qui affecte négativement la transcription en recrutant le facteur répresseur de la transcription NELF (Negative Elongation Factor) (Figure 15-1)F# G,<&# /1)%6.,# ,-# 602<<%4%62.&(-# +,# ./2-)</&.)# <(%/.)# $%&# ),/(-.# ,-)%&.,# 4%6.&-épissés et exportés dans le cytoplasme par la machinerie de transport classique des ARNm et finalement traduit par la machinerie de traduction cellulaire pour donner les protéines virales Tat, Rev et ?,CF#!(/)$%,#J2.#,).#'/(+%&.,#,-#$%2-.&.1#)%CC&)2-.,8#,66,#),#6&,#9#62#)1$%,-<,#J=>#+,#60=>?E# en cours de transcription et recrute le complexe P-TEFb (Positive Elongation Factor b) composé de la cycline T1 et CDK9 (Cyclin-Dependant Kinase 9) (Figure 15-2) (Dingwall et al., 1990; Dingwall et al., 1989; Zhou et al., 2003)F# GPnh# 'O()'O(/N6,# 60,;./14&.1# G-.,/4&-26,# +,# 60=>?'VV# 2%34,-.2-.# )2# '/(<,))&E&.1# (Figure 15-3) ainsi que DSIF et NELF ',/4,..2-.# 6,%/# )1'2/2.&(-# +,# 60=>?'VV# (Figure 15-2) et la stimulation de la transcription. !02<1.N62.&(-#de Tat par P300/CBP et hGCN5 au niveau des lysines K50 et K51 entraine sa dissociation de la séquence TAR (Figure 15-4) (Bres et al., 2002; Kaehlcke et al., 2003).

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Figure 15 : Activation de la transcription par la protéine virale Tat. (1) L'ARN polymérase II (ARNpII) hypophosphorylée sur son domaine C-terminal (CTD) possède une faible processivité et est associée à des C2<.,%/)#-132.&C)#+016(-32.&(-#+,#62#./2-)</&'.&(-#@?W!d#,.#P VdBF#(2) Tat se fixe spécifiquement au niveau de la )1$%,-<,#J=>#+,#60=>?#E&/26#-,()N-.O1.&)1#,.#/,</%.,#6,#<(4'6,;,#I-JWdD8#<(4'()1#+,#62#<N<6&-,#J7#,.#+0%-,# kinase CDK9. (3) GPnh#ON',/'O()'O(/N6,#60=>?'VV#2%#-&E,2%#+,#)(-#GJP#<,#$%&#2%34,-.,#)2#'/(<,))&E&.1. (4) L'acétylation de Tat et son interaction avec PCAF (p300/CREB binding protein-associated factor) entraine sa +&))(<&2.&(-#+,#62#)1$%,-<,#J=>#,.#).&4%6,#6016(-32.&(-#+,#62#./2-)</&'.&(-#(Strebel, 2003).

I.3.6. Epissage, export nucléaire et traduction des ARNm