24 clones de chacune des constructions H et J après recombinaison ont été piqués au hasard et amplifiés. La production d’anticorps complet a été testée en ELISA pour 14 clones et les 5 meilleurs de chaque construction ont été été testée par western-blot (Figure 33). Pour écarter tout risque de contamination, l’identité des dix clones a d’abord été contrôlée par PCR et restriction et les clones correspondent bien aux constructions H et J. Après 7 jours de culture en milieu 4% de sérum, quelques microlitres de surnageant de culture ont été prélevés et déposés sur gel en conditions non réductrices (Figure 33A). Un échantillon de cetuximab commercial est utilisé comme témoin de migration et de détection. Après transfert, le gel a d’abord été analysé à l’aide d’un anti-Fab humain plutôt spécifique de la chaine légère (Figure 33A gauche). Tous les clones montrent une bande majeure co-migrant avec le cetuximab, démontrant l’expression par ces clones d’une immunoglobuline complète avec ses ponts disulfures inter-chaines. Il existe quelques bandes de plus bas poids moléculaire et de plus faible intensité mais les échantillons n’étant pas purifiés, il n’est pas possible de conclure entre des formes anormales d’IgG ou un signal non-spécifique de l’anticorps. On révèle toutefois clairement une banque vers les 25 kDa qui pourrait correspondre à de la chaine légère non associée à la chaine lourde, ce qui est fréquent dans les hybridomes et les systèmes d’expression d’IgG recombinantes. Les mêmes échantillons ont également été révélés à l’aide d’un anticorps anti-Fc humain pour visualiser la chaine lourde. On révèle également la bande majeure ce qui confirme la présence des deux chaines de l’IgG. Ce second anticorps révèle aussi des formes plus courtes peut-être dues à des épissages anormaux ou de la dégradation, mais pas la bande vers 25 kDa attribuée à la chaine légère. Finalement, les cinq clones provenant de la construction J sont plus fortement exprimés que ceux provenant de la construction H. Par comparaison, avec le signal obtenu pour le cetuximab purifié, la production est estimée à environ 0,8 µg/mL pour les clones J et 0,2 µg/mL pour les clones H.
Bien qu’une protéine majeure co-migrant avec une IgG complète et comportant les deux chaines lourdes et légères ait été détectée, ce premier résultat ne démontre pas une fonctionnalité de la protéine. Pour s’en assurer, un ELISA contre la βgalactosidase a été réalisé à l’aide des surnageants de culture des dix clones. La présence d’anticorps complets anti-βgalactosidase est mise en évidence par l’ajout d’un anti-Fc humain couplé à la HRP puis de substrat TMB. Le résultat montre que tous les clones J produisent des anticorps aptes à se lier à leur cible (Figure 33B). De plus, l’utilisation d’un anticorps secondaire reconnaissant spécifiquement la partie Fc démontre que tous les clones expriment un Fab associé à un Fc puisqu’un Fab ou un (Fab’)2 ou un Fc seul ne peuvent donner de signal dans ce test.
Comme dans l’analyse par western-blot, le signal obtenu avec les clones J est bien plus fort que celui obtenu avec les clones H. La quantité d’IgG actives produite par les clones et détectée par cet ELISA a
98 été déterminée avec une courbe de normalisation utilisant une production purifiée du même anticorps anti-βgalactosidase obtenu à l’aide d’un vecteur classique de production dans une lignée HEK293.
Figure 33: Production d’immunoglobulines complètes en lignée stable
A – Western-blot : la co-migration avec l’IgG cetuximab indique la présence d’immunoglobulines complètes sécrétées dans le milieu de culture cellulaire des clones H et J. L’intensité des signaux reflète néanmoins une production plus faible pour la construction H. Le gel de droite est révélé par un anti-Fc humain mettant en évidence la chaine lourde. Le gel de gauche est révélé avec un anti-Fab humain révélant préférentiellement la chaine légère, ce qu’on observe au bas du gel.
B – Histogramme : cet histogramme illustre les résultats d’un ELISA anti-βgalactosidase révélé par un anti-Fc humain couplé à la HRP. Il met en évidence les concentrations d’immunoglobulines complètes fonctionnelles obtenues dans le surnageant de culture non purifié. La construction J se révèle mieux produite que la construction H comme constaté par western-blot et conserve ses propriétés de liaison à l’antigène. Le signal ELISA a été converti en quantité à l’aide d’une courbe de calibration obtenue avec de l’IgG 13R4 purifiée.
99 Finalement, un kit basé sur la méthode HTRF (Cisbio) a été utilisé pour déterminer la quantité d’immunoglobulines humaines produite. Les trois méthodes montrent toujours une production bien supérieure pour les clones J (Figure 34). Il est normal que les trois méthodes ne donnent pas des valeurs directement comparables car elles ne mesurent pas exactement les mêmes espèces. En particulier, la mesure en ELISA est certainement la plus intéressante car elle représente la production d’une IgG fonctionnelle par la cellule. Au final et en moyenne, nous estimons la production des clones J à environ 1 µg/mL d’IgG1 dans le surnageant.
Figure 34: ScatterPlot - Représentation des productions d’IgG selon différentes techniques d'analyse
La quantification de la production de cinq clones H et de cinq clones J a été réalisée selon différentes techniques (western-blot, ELISA, kit HTRF avec analyse sous Excel ou GraphPad). Le résultat montre que les clones J produisent mieux l’anti-βgalactosidase que les clones H.
100 De façon à optimiser légèrement les conditions de production des clones J, une cinétique de production a été réalisée dans deux conditions de sérum (Figure 35). Les clones sont mis en culture en présence de 10% de sérum jusqu’à environ 70-80% de confluence, puis le milieu de culture est remplacé par un milieu réduit en sérum (0 ou 4%). Après quatre jours, des prélèvements successifs de quelques microlitres par jour sont effectués (jour 4, 5, 6, 7, 10 et 11) et l’IgG produite est quantifiée par ELISA comme précédemment. Dans les deux conditions, les cinq clones produisent de l’IgG active dans le surnageant, détectable dès le quatrième jour et toujours en quantité plus importante en présence de sérum. De plus, la production augmente jusqu’au onzième jour en présence de sérum alors que la plupart des clones ne produisent plus après le septième jour en absence de sérum. On peut observer une très faible variabilité inter-clones (0,5 – 1 µg/mL après dix jours) grâce à l’insertion dirigée utilisée dans notre système permettant ainsi de s’affranchir d’un test de clones multiples.
Compte-tenu de ces résultats, nous utiliserons désormais uniquement le design J qui a été renommé pDC10 pour le vecteur de display et dont la carte est représentée en Figure 36.
Figure 35: Cinétique de production d’IgG
La production d’IgG de différents clones J a été testée. Chaque clone est cultivé puis privé de sérum (0 ou 4%). 300 µL de surnageant de culture sont prélevés à différents jours post-sevrage. 100 µL d’échantillons sont testés en ELISA (contre la β-galactosidase). La révélation s’effectue avec un anti-Fc humain. Chaque barre correspond à un jour différent. La production en 4% sérum semble plus efficace et ralentir dès le 10e jour.
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