Chapitre I: Caractérisation structurale et fonctionnelle d'une peptide deformylase atypique
C.3- Production d’anticorps dirigés contre Vp16PDF
L’obtention de la protéine Vp16PDF pure nous a permis de stimuler la production d’anticorps dirigés contre la protéine par immunisation de lapins (voir Matériels et Méthodes). La caractérisation de ces anticorps sur des extraits bruts bactériens nous a permis de démontrer leur spécificité : ils reconnaissent exclusivement la PDF de phage et pas celle d’E. coli (Figure I-5). Un signal unique et intense est observé dans les extraits bruts surexprimant Vp16PDF, correspondant à une protéine ayant une taille d’environ 14 kDa, comparable à celle attendue d’après sa séquence codante (Figure I-2). Ces anticorps spécifiques et de haute affinité sont devenus un outil très puissant pour la suite de mes études. Ils sont utilisé à une dilution de 1/5000 durant les expériences.
Chapitre I
65
Figure I-5 : Test des anticorps-anti-Vp16PDF. Pour chaque gel, 10ng, 50ng et 100ng de protéine purifiée ont
été déposés, et comparés à un aliquote d’extrait brut (EB). Chaque membrane a été incubée avec une dilution d’anticorps primaire variable (1/1000, 1/2000, 1/5000 et 1/10000), suivie d’une incubation en présence d’anticorps secondaire porteur d’un fluorophore. La fluorescence a ensuite été détectée, révélant une bande spécifique entre 10 et 15 kDa, qui correspond à Vp16PDF.
C.4 - L’extrémité C-terminale très courte de Vp16PDF stabilise fortement
la protéine
Grâce à différentes collaborations, nous avons pu caractériser la stabilité thermique de Vp16PDF en utilisant deux techniques différentes.
En collaboration avec la plateforme « Mesures d’interaction des macromolécules » (PIM) de l’I2BC, la stabilité thermique de Vp16PDF a été mesurée par la technique DSC (« differential scanning calorimetry »), qui mesure la variation de capacité calorifique associée à la dénaturation de la molécule lorsque celle-ci est chauffée à vitesse constante. Le thermogramme obtenu permet alors de déterminer une température de transition notée Tm.
A titre de comparaison, la valeur Tm a été mesurée pour Vp16PDF ainsi que pour
d’autres PDFs (la valeur Tm associée à la PDF1B d’A. thaliana (AtPDF1B) est tirée de
précédentes expériences réalisées dans les mêmes conditions 235). Il est à noter que les protéines ont systématiquement précipité à haute température, donnant des thermogrammes qui ne peuvent pas être pleinement analysés (c’est-à-dire que les variations d’enthalpie et d’entropie ne sont pas quantifiables), mais permettant tout de même une bonne estimation du Tm associé à
chaque protéine testée.
Les PDF 1Bs d’E. coli et A. thaliana ont une stabilité thermique semblable, avec un Tm
de 60°C et 61°C respectivement (Figure I-6 et 235). Le Tm de la PDF1B de Thermus thermophilus (TtPDF) est bien plus élevé (73°C, Figure I-6), vraisemblablement car elle est produite par une bactérie hyperthermophile. De manière intéressante, le Tm mesuré de Vp16PDF
Chapitre I
66 est également élevé, avec une valeur de 68°C (Figure I-6). Cette valeur est très proche de celle obtenue avec une version de la PDF d’E. coli dont l’extrémité C-terminale a été tronquée (variant 1-148 ; Tm = 72°C, Figure I-6). Ce résultat signifie que l’absence d’hélice alpha en C-
terminal stabilise significativement les PDFs de type 1B, effet qui avait déjà été observé lors d’une précédente étude avec EcPDF 92.
La stabilité thermique de Vp16PDF a également été analysée par la technique de thermofluor ou FTSA (« Fluorescence-based Thermal Shift Assay »), en collaboration avec Eric Jacquet à l’Institut de Chimie des Substances Naturelles (ICSN, Gif-sur-Yvette). Cette technique est basée sur l’analyse des variations de l’intensité de fluorescence de colorants fluorescents, tels que le Sypro Orange, en présence de la protéine et en fonction de la température ; le fluorophore fluoresce lorsqu’il est en contact avec les régions hydrophobes des protéines, régions qui sont progressivement exposées à mesure que la protéine est dénaturée par la température croissante. Les courbes de fluorescence obtenues sont dérivées afin d’avoir accès à la température de demie-dénaturation Tm.
La dénaturation thermique de Vp16PDF a été mesurée pour différentes concentrations de protéine (de 13 à 49 µM) ; la protéine étant stockée dans un tampon 50 mM MES-KOH pH5,5, 5 mM NiCl2 et diluée dans un tampon 50 mM MES-KOH pH5,5 sans NiCl2, une quantité
résiduelle de NiCl2 était présente dans les échantillons (de 208 à 750 µM). Cette première série Figure I-6: Stabilité thermique de différentes PDFs de type 1B dont Vp16PDF. La stabilité thermique de
différentes PDFs de type 1B a été mesurée par la technique DSC. Les températures apparentes de transition Tm ont été déduites des thermogrammes après correction de la ligne de base. En rouge: Vp16PDF, bleu: EcPDF, vert: EcPDF variant 1-148, noir: TtPDF.
Chapitre I
67 de tests a permis de déterminer un Tm égal à 67 ± 1°C (Figure I-7A courbes bleues), égal à celui
déterminé par DSC (Figure I-6). L’ajout de 7,5 mM EDTA, a fortement modifié le comportement de Vp16PDF. En effet, nous avons pu observer i) une augmentation de la fluorescence du fluorophore associée à la dénaturation de Vp16PDF, ii) une diminution significative du Tm (61 ± 1°C), et iii) l’apparition d’une phase précoce de dénaturation entre 30
et 45°C (Figure I-7A courbes vertes). Ce résultat suggérait une influence du NiCl2 sur la
conformation et la stabilité de la protéine, son absence contribuant à une stabilité moindre. Nous avons alors purifié Vp16PDF en absence totale de nickel afin de procéder à de nouveaux tests. La protéine ainsi purifiée en absence de NiCl2 s’est avérée aussi stable, que ce soit en absence
ou en présence de NiCl2 supplémentaire dans l’échantillon (Tm = 70 ± 1°C et 68 ± 1°C, Figure
I-7B courbes noire et verte respectivement). En revanche, l’ajout de 2 mM EDTA a comme précédemment modifié le comportement de la protéine (diminution du Tm (62 ± 1°C) et
apparition d’une phase précoce de dénaturation, voir Figure I-7B courbe rouge). La protéine testée ayant été purifiée en absence de nickel, ce dernier résultat suggère un lien entre la stabilité de Vp16PDF et la présence d’un ou plusieurs métaux lié(s) intrinsèquement à la protéine et non pas ajoutés au cours de la purification ou de l’expérience. De plus, Vp16PDF ayant un pI particulièrement élevé en comparaison d’autres PDFs, nous avons souhaité tester l’influence du pH sur sa stabilité (les expériences ont été réalisées en utilisant la protéine purifiée en absence de NiCl2). Nous avons ainsi pu constater que la protéine était déstabilisée lorsqu’elle était diluée
dans un tampon à pH 4,0 au lieu de 5,5 (Tm = 52 ± 1°C, avec une forte diminution de la
fluorescence, Figure I-7C courbes bleues). De plus, les résultats précédents ont été confirmés, à savoir une stabilité inchangée par l’ajout de 2 mM NiCl2 (Tm = 51 ± 1°C), mais diminuée en
présence d’EDTA (Tm = 45 ± 1°C) (Figure I-7D courbes vertes et rouges respectivement).
Bien que ces résultats soient encore préliminaires et mériteraient d’être approfondis, il en ressort un lien évident entre la stabilité de la protéine et le tampon dans lequel elle est purifiée et/ou diluée, tant au niveau de l’influence du pH que du métal lié au niveau du site actif et/ou à d’autres sites non identifiés jusqu’ici.
Chapitre I
68
Figure I-7 : Influence des métaux et du pH sur la stabilité thermique de Vp16PDF. La stabilité thermique de Vp16PDF a été mesurée par la technique de thermofluor. L’effet du NiCl2, de l’EDTA et du pH a été testé. Les températures apparentes de transition Tm ont été déduites à partir de la dérivation des courbes de fluorescence obtenues en fonction de la température. Pour chaque condition l’expérience est répétée deux fois. A) Vp16PDF stockée dans un tampon 50 mM MES-KOH pH 5,5, 5 mM NiCl2 a été diluée dans un tampon 50 mM MES-KOH pH 5,5, conduisant à une concentration résiduelle de NiCl2 de 750 µM, et contenant ou non de l’EDTA à 7,5 mM.
B) Vp16PDF purifiée en absence totale de NiCl2 et stockée dans un tampon 50mM MES-KOH pH 5,5 a été diluée dans un tampon contenant au final 2 mM de NiCl2 ou d’EDTA. A titre de contrôle, la protéine a été diluée dans le tampon 50mM MES-KOH pH 5,5 seul (courbe noire). C) Vp16PDF purifiée en absence totale de NiCl2 et stockée dans un tampon 50 mM MES-KOH à pH 5,5 ou 4,0. D) Même expérience que C mais avec ajout de 2 mM de NiCl2 ou d’EDTA.
Chapitre I
69